Глава 6

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГРУПП КРОВИ

Групповая дифференциация присуща не только эритроцитам, но и другим форменным элементам крови, а также белкам плазмы. Для практической медицинской деятельности наиболее важен учет групповых различий эритроцитов, потому что именно он лежит в основе определения совместимости крови и предупреждения возможных осложнений при гемотрансфузиях.

Определение группы крови – это несложная, но очень ответственная процедура. Поэтому врач должен контролировать правильность проведения исследования и оценивать его результаты.

Группу крови в системе АВ0 определяют, исследуя эритроциты индивидуума в реакциях гемагглютинации с анти-А и анти-В сыворотками. Результаты этой реакции обычно подтверждают, выявляя "нормальные" анти-А- и анти-В-антитела. В сыворотке, как правило, присутствуют "нормальные" антитела только к тем антигенам, которые не экспрессированы на эритроцитах данного индивидуума.

Прежде чем приступить к исследованию, необходимо убедиться, что флаконы со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками правильно расположены в штативе, прозрачны, не содержат осадка и срок годности, указанный на их этикетках, не истек.

Ниже в таблице показаны результаты реакции с диагностическими препаратами сывороток и эритроцитов при группах крови А, В, О и АВ.

Определение группы эритроцитов:

1. В четыре пробирки вносят сыворотку анти-А.
2. В другие четыре пробирки вносят сыворотку анти-В.
3. Отмытые эритроциты из исследуемого образца крови вносят в первую пробирку с анти-А и в первую пробирку с анти-В сывороткой.
4. Отмытые стандартные эритроциты серогрупп А, В и 0 добавляют соответственно во вторую, третью и четвертую пробирки с анти-А и анти-В-сыворотками для контроля реагентов.
5. Тщательно перемешивают содержимое всех пробирок.
6. Инкубируют 1 ч при комнатной температуре.
7. Результаты (наличие или отсутствие агглютинации) учитывают визуально или под микроскопом.

Определение группы сыворотки:

1. Порции плазмы или сыворотки из исследуемого образца крови вносят в три пробирки.
2. В каждую пробирку добавляют отмытые стандартные эритроциты одной из трех групп: А, В или 0. Хорошо перемешивают.
3. Инкубируют 1 ч при комнатной температуре.
4. Результаты (наличие или отсутствие агглютинации) учитывают визуально или под микроскопом.

В условиях отечественных клиник более широкое распространение получила методика определения группы крови по системе АВ0 на плоскости (фарфоровая тарелка или пластинка). Ее достоинство в том, что она менее громоздка. Технически ее проведение состоит из следующих операций.

В левой части пластины делают надпись 0, в правой – В и по центру – А. Сверху пишется фамилия и инициалы исследуемого, у которого определяют группу крови.

Исследование проводится в 2 сериях стандартных сывороток. Под соответствующими обозначениями наносятся на плоскости по большой капле стандартной сыворотки (сверху – одна серия, под ней – другая). Таким образом получается 6 капель сывороток: 2 ряда по 3 капли. Кровь от больного получают непосредственно во время исследования. При помощи пипеток или стеклянных палочек по маленькой капле исследуемой крови наносят на плоскость рядом со стандартными сыворотками. После чего каждую каплю крови и сыворотки перемешивают. Пластину покачивают не менее 5 мин и добавляют по одной капле изотонического раствора хлорида натрия. Учет результатов реакции проводят не ранее чем через 5 мин.

Также используется перекрестный метод определения групп крови, в котором определяются и группа эритроцитов, и группа сыворотки. Эта методика используется главным образом для повторной проверки группы крови у доноров.

Иногда результаты определения групп крови по фенотипу эритроцитов и специфичности нормальных сывороточных гемагглютининов не совпадают с ожидаемыми. Следует отметить, что анти-А и анти-В-реагенты, как правило, высокоавидны и активно агглютинируют эритроциты, экспрессирующие соответствующие антигены. Менее выраженную реакцию при определении фенотипа эритроцитов считают аномальной. В то же время при определении сывороточных гемагглютининов более слабая агглютинация клеток наблюдается довольно часто.

Причины аномальных реакций можно суммировать следующим образом:

1. Очень слабая реакция при определении сывороточных гемагглютининов наблюдается в следующих случаях:

а) если при постановке реакции используют эритроциты с несоответствующими подгруппами антигенов А и В;

б) если реакцию проводят с образцами сывороток престарелых людей, детей раннего возраста или больных;

в) если исследуют сыворотку близнецов с иммунологическим химеризмом (в практике встречается довольно редко).

2. "Неожиданные" реакции при определении фенотипа эритроцитов в системе групп крови АВ0 происходят в таких случаях:

а) когда эритроциты фенотипов редких подгрупп типируют при помощи анти-А реагента;

б) когда для типирования применяют антитела, специфичные к антигенам другой группы крови.

3. Слабая или "смешанная" агглютинация исследуемых эритроцитов под действием анти-А или анти-В-реагентов регистрируется в следующих случаях:

а) А-антигены эритроцитов принадлежат к редкой подгруппе;

б) исследуемые эритроциты способны к полиагглютинации;

в) эритроциты получены от близнецов с иммунологическим химеризмом или от больного, которому недавно перелили кровь.

В эритроцитах человека имеются 5 основных антигенов системы резус (D, C, c, E, e), из которых наиболее иммуногенным является антиген D – Rh(D). Наличие или отсутствие этого антигена определяет резус-принадлежность крови: лица, имеющие D-антиген, принадлежат к группе резус-положительных (среди лиц белой расы их приблизительно 85%); лица, не имеющие его, относятся к резус-отрицательным (их, соответственно, около 15%).

Иммуногенность других (минорных) антигенов системы Rh значительно ниже и убывает в ряду: с>Е>С>е. Определение минорных антигенов системы резус, как правило, производится при необходимости многократных трансфузий, в тех случаях, когда в сыворотке реципиента обнаружены иммунные антитела к антигенам системы резус, в том числе при индивидуальном подборе крови.

Антиген D имеет слабые варианты, объединяемые в группу Dweek (Du), частота которой в популяции составляет около 1% . Эти эритроциты слабо или вообще не агглютинируются полными анти-Rh-антителами в реакции прямой агглютинации.

Доноры, содержащие Du, должны быть отнесены к резус-положительным, так как, во-первых, переливание их крови сенсибилизированным к D-антигену резус-отрицательным реципиентам может вызвать тяжелые трансфузионные реакции и, во-вторых, может вызвать иммунный ответ у резус-отрицательных реципиентов. Поэтому кровь доноров должна обязательно тестироваться на присутствие Du и, в случае его обнаружения считаться резус-положительной.

Реципиенты, содержащие антиген Du, должны быть отнесены к резус-отрицательным и им должна быть перелита только резус-отрицательная кровь, так как нормальный антиген D может вызвать у таких лиц иммунный ответ. Поэтому кровь реципиентов не обязательно тестировать на присутствие Du.

Резус-принадлежность определяется в реакции агглютинации с помощью моноклональных реагентов или изоиммунных антирезусных сывороток, предназначенных для выявления Rh(D)-aнтигена в реакции прямой агглютинации (на плоскости и в пробирочном тесте; в солевой среде; в присутствии высокомолекулярных усилителей; с эритроцитами, обработанными протеолитическими ферментами) или в непрямом антиглобулиновом тесте (непрямая проба Кумбса). Метод определения зависит от класса антител в реагенте: если в нем присутствуют полные антитела (класса IgM), то реагент используется для определения резус-фактора методом прямой агглютинации в солевой среде; если в нем содержатся неполные антитела (класса Ig G), то он используется в реакции агглютинации в присутствии высокомолекулярных усилителей (альбумина, желатины и др.), с эритроцитами, обработанными протеолитическими ферментами, в непрямом антиглобулиновом тесте .

Определение проводят в помещении с хорошим освещением. Наилучшие результаты тест дает при использовании высокой концентрации эритроцитов и температуре около +37° С, поэтому желательно использовать подогретую пластинку. Для исследования используют цельную кровь, отмытые эритроциты, эритроциты в плазме, сыворотке, консерванте или физиологическом растворе.

Процедура проводится в следующей последовательности:

1. Наносится большая капля (около 0,1 мл) реагента на пластинку или планшет.
2. Рядом наносится маленькая капля (около 0,03 мл) исследуемой крови (эритроцитов).
3. Тщательно смешивается реагент с кровью чистой стеклянной палочкой.
4. Через 10–20 с пластинка мягко покачивается. Несмотря на то, что четкая агглютинация наступает в первые 30 с, результаты реакции следует учитывать через 3 мин после смешивания.
5. Результаты реакции записываются немедленно после окончания.

При наличии агглютинации исследуемая кровь маркируется как резус-положительная, если агглютинация отсутствует – как резус-отрицательная. Если агглютинация намного слабее наблюдаемой с Rh (D)-положительными эритроцитами, исследуемая кровь принадлежит к подгруппе слабых антигенов Rh – Du. Для уточнения принадлежности такого образца крови к группе Du исследование проводят со вторым реагентом, содержащим IgG (неполные) анти-D антитела (см. гл. 6.2.2.3).

Реакция проводится либо со специально приготовленным реагентом, уже содержащим усилитель (универсальный реагент с полиглюкином или альбумином для плоскости), либо усилитель добавляют в процессе проведения реакции (реакция конглютинации с желатином в пробирке).

Техника постановки реакции агглютинации на плоскости не отличается от описанной в гл.6.2.2.1. Однако универсальные реагенты могут давать ложноположительную реакцию с резус-отрицательными эритроцитами за счет содержащихся в них высокомолекулярных веществ, а также могут вызывать агглютинацию эритроцитов, покрытых антителами другой (не антирезус) специфичности. Поэтому необходимо проведение параллельных тестов с контрольным раствором используемого усилителя, но без анти-0-антител. Если контрольный раствор вызывает агглютинацию эритроцитов, то результаты тестирования не достоверны и следует повторить определение с другим реагентом, содержащим полные антитела IgM (лучше с моноклональными).

Реакции конглютинации с применением желатина. Для проведения этого теста могут быть использованы моноклональные реагенты и стандартные изоиммунные антирезус сыворотки с неполными антителами.

1. Вносят в пробирку 1 каплю (около 0,05 мл) исследуемой крови или взвеси эритроцитов (примерно 50%) в сыворотке.
2. Добавляют 2 капли (0,1 мл) 10% раствора желатина, предварительно подогретого до разжижения при +46...+48°С.
3. Добавляют 2 капли (0,1 мл) реагента анти-D и смешивают.
4. Помещают пробирку в водяную баню с температурой +46...+48°С на 5–10 мин или в суховоздушный термостат при той же температуре на 30 мин.
5. Доливают в пробирку 5–8 мл физиологического раствора и осторожно 1–2 раза переворачивают закрытую пробкой пробирку для перемешивания.
6. Определяют наличие агглютинатов, просматривая пробирку на свет невооруженным глазом или через лупу.
7. Немедленно записывают результаты определения.

Желатиновая проба требует обязательного проведения следующих контролей:

со стандартными резус-положительными эритроцитами;

со стандартными резус-отрицательными эритроцитами;

с исследуемыми эритроцитами и раствором желатина, но без анти-0-антител.

При положительном результате агглютинаты различимы в виде агрегатов разной величины на прозрачном фоне – кровь является резус-положительной. При отрицательном результате в пробирке агрегатов нет, а видна равномерно окрашенная непрозрачная взвесь эритроцитов – кровь является резус-отрицательной. Если наблюдается мелкозернистая, вызывающая сомнение агглютинация, то кровь необходимо тестировать в непрямом антиглобулиновом тесте (см. гл.6.2.2.3). Результаты желатиновой пробы являются достоверными только в случае, когда желатин сам не вызывает агглютинацию исследуемых эритроцитов, а результаты контролей со стандартными эритроцитами соответствуют ожидаемым. В случае неадекватных результатов контролей определение резус-принадлежности следует повторить с использованием другого реагента или образца желатина. Если желатин вызывает сам по себе агглютинацию исследуемых эритроцитов, то можно предполагать наличие на них антиэритроцитарных антител антирезус или иной специфичности (это наблюдается при гемолитической болезни новорожденных, аутоиммунной гемолитической анемии и некоторых инфекционных заболеваниях). В этом случае кровь должна быть направлена на исследование в специальную серологическую лабораторию.

1. Приготовить 2–5% взвесь трижды отмытых в физиологическом растворе исследуемых эритроцитов. Для этого поместить в пробирку 5 капель (около 0,25 мл) исследуемой крови, трижды отмыть в 5–10 мл физиологического раствора; суспендировать осадок эритроцитов в 2–3 мл физиологического раствора или, предпочтительнее, в 2–3 мл раствора LISS, в котором фиксация антител на эритроцитах прочнее и происходит быстрее, чем в физиологическом растворе.
2. Внести 1 каплю анти-0-реагента в чистую маркированную пробирку.
3. Добавить 1 каплю 2–5% взвеси эритроцитов.
4. Инкубировать смесь при +37°С 30–45 мин (если эритроциты взвешены в физиологическом растворе) или 10–15 мин (если эритроциты взвешены в LISS).
5. Отмыть эритроциты 1 раз (в случае использования мо-ноклонального реагента) или 3 раза (в случае использования изоиммунной анти-0-сыворотки) большим объемом (5–10 мл) физиологического раствора. Однократная отмывка допустима только при использовании моноклональных реагентов. Полностью удалить физиологический раствор.
6. Добавить к осадку 1 каплю антиглобулинового реагента и тщательно смешать.
7. Центрифугировать 15–20 с при 2 000–3 000 об./мин.
8. Мягко ресуспендировать осадок и визуально определить наличие агглютинации.
9. Немедленно записать результаты определения.

При отсутствии агглютинации кровь является резус-отрицательной. При положительной реакции – резус-положительной; подгруппы Du могут вызывать слабую агглютинацию даже в этом высокочувствительном тесте. Прежде чем отнести донора Du к резус-положительным следует подтвердить заключение контрольным исследованием антиглобулиновой сыворотки со стандартными эритроцитами. Если контрольный тест положительный, интерпретация не является достоверной. В этом случае реципиент должен получать только резус-отрицательную кровь (эритроциты), а кровь такого донора не должна использоваться для трансфузий до окончательного выяснения его резус-принадлежности.

Неполные антитела способны вызывать прямую агглютинацию в солевой среде эритроцитов, обработанных бромелином, папаином, трипсином и другими протеазами. Этот метод высокочувствителен и надежен при выявлении слабых форм D-антигена. Он используется, главным образом, при автоматическом определении групп крови в системах "Gruppomatic”, в которых обеспечивается стандартность обработки эритроцитов ферментами и специально подбирается нужное разведение реагента, так как для этого теста характерен феномен прозоны (ингибирование агглютинации избытком антител).

При неавтоматизированном определении групп крови метод может быть использован в специализированных серологических лабораториях.

Пробы на совместимость групп крови АВ0 и Rh производятся отдельно. Выполняются эти пробы разными методами в связи с тем, что антитела системы АВ0 и резус-системы имеют разные свойства и проявляют свое действие при различных условиях.

Целью пробы на индивидуальную совместимость является предотвращение трансфузий несовместимых эритроцитов. Проба на совместимость производится врачом, переливающим кровь, непосредственно перед трансфузией. Для этого используют сыворотку больного и кровь донора из флакона, подготовленного для переливания.

Тестирование сыворотки реципиента с эритроцитами предполагаемого донора – наиболее надежный способ выявления антител, способных вызвать повреждение перелитых эритроцитов, посттрансфузионные реакции, в том числе гемолитические. Проведение такой пробы позволяет: подтвердить АВ0-совместимость донора и реципиента; выявить практически все антитела в сыворотке реципиента, направленные против эритроцитов донора.

Во всех случаях, кроме срочных трансфузий, проба проводится в два этапа (первый – без использования антиглобулинового реагента, второй – с антиглобулиновым реагентом).

Первый этап:

Поместить 2 капли сыворотки реципиента в маркированную пробирку.

Добавить 1 каплю 5% взвеси трижды отмытых эритроцитов донора в физиологическом растворе (фиксация антител происходит лучше в растворе низкой ионной силы (LISS), поэтому предпочтительнее взвесить эритроциты в растворе LISS, обычно поставляемом изготовителем вместе с антиглобулиновым реагентом).

Немедленно центрифугировать при 2000 об./мин в течение 15–20 с.

Просмотреть супернатант на наличие гемолиза, мягко покачивая пробирку, отделить клеточный осадок от дна пробирки и определить наличие агглютинатов. Наличие гемолиза и/или агглютинатов на этой стадии может означать:

несовместимость по системе АВ0;

присутствие в сыворотке реципиента полных холодовых антител по специфичности АВ0 (анти-S, анти-P1 и др.).

Второй этап:

Если гемолиз отсутствовал, а после встряхивания пробирки эритроциты образовали гомогенную суспензию, инкубировать пробирку 30–40 мин (при использовании LISS время инкубации составляет 10–15 мин) при +37°С.

Центрифугировать пробирку (см. п. 3) и просмотреть супернатант на наличие гемолиза и агглютинатов. Наличие гемолиза и/или агглютинатов (после встряхивания пробирки) говорит о присутствии у реципиента полных тепловых антител против эритроцитов донора.

Если агглютинация и гемолиз отсутствуют, отмыть эритроциты 3–4 раза большим объемом (не менее 5 мл) физиологического раствора (недостаточное отмывание может привести к инактивации антиглобулинового реагента и ложноотрицательному результату теста, поскольку сыворотка даже в разведении 1:4 000 инактивирует равный объем антиглобулинового реагента); удалить полностью физиологический раствор после последнего отмывания.

Добавить 1–2 капли антиглобулиновой сыворотки и тщательно смешать.

Центрифугировать пробирку (см. п. 3), мягко разбить осадок и просмотреть пробирку на наличие агглютинатов.

В случае необходимости срочной трансфузии можно ограничиться только 1–4-й стадиями пробы на совместимость. В этом случае допускается также проведение теста на индивидуальную совместимость на плоскости путем смешивания 1 капли сыворотки реципиента с маленькой каплей крови донора (соотношение сыворотки и крови должно быть около 10:1). В такой постановке проба на индивидуальную совместимость сводится фактически к выявлению несовместимости только по системе АВ0.

Донор считается совместимым, если ни на одной стадии пробы на индивидуальную совместимость не наблюдается ни гемолиза, ни агглютинации. Агглютинация свидетельствует о наличии аллоантител в сыворотке реципиента, специфичность которых может быть выявлена в специальной серологической лаборатории исследованием с панелью типированных эритроцитов. Такие реципиенты нуждаются в специальном подборе донора.

Качество антиглобулинового реагента гарантируется изготовителем. Не следует использовать реагент с истекшим сроком годности или после повторного замораживания–оттаивания. Полезно в качестве контроля (если у вас возникли сомнения в качестве реагента) провести антиглобулиновый тест с резус-положительными эритроцитами, сенсибилизированными неполными анти-0-антителами.