Осипов Г.А., Бойко Н.Б.
Академическая группа Акад.РАМН Ю.Ф.Исакова,
Москва, Россия, факс 095 2541039,
e-mail osipovga@rusmedserv.com

Практически везде в профиле минорных компонентов (уровень содержания менее 1%) биологических жидкостей человека присутствует 3-гидроксиоктадекановая кислота (h18). Она отсутствует лишь у новорожденных, некоторых подростков и иногда у взрослых. Клетки человека не производят 3-гидроксикислот. В природе они встречаются лишь в клетках грамотрицательных микроорганизмов в составе липида-А липополисахарида клеточной стенки, и поэтому служат удобными маркерами для обнаружения грамотрицательной инфекции [1]. Известно, что именно Helicobacter pylori, в отличие от близкородственных микроорганизмов содержат кислоту h18 [2]. Она характерна также для микроорганизмов родов Francisella, Brucella, которые относятся к эпидемическим агентам туляремии и бруцеллеза и их присутствие у обследуемых нами пациентов маловероятно. H.pylori традиционно связывают с гастроэнтеритами, и нет сведений о колонизации им организма человека вне связи с этими заболеваниями. С помощью чувствительного метода газовой хроматографии - масс-спектрометрии (ГХ-МС) по селективным ионам мы определили наличие h18 непосредственно в моче, крови, вагинальной жидкости, семени и других субстанциях без предварительной инкубации на превалирующем фоне биологического субстрата. Ее содержание в моче 98 обследованных пациентов уролога коррелирует с наличием гастроэнтеритов и составляет в среднем 0,4мкг/мл у людей без язвенной болезни и 1,2-4мкг/мл при ее клинических симптомах. Корреляция с содержанием маркера в крови выражена слабее. В вагинальном содержимом уровень концентрации h18 составляет в среднем 0,1мкг/мл, однако у трех женщин (из 55 пациенток гинеколога) обнаружено более чем четырехкратное превышение этого уровня. В семени мужчин среднее содержание h18 находится на уровне 0,4мкг/мл, при этом в четырех случаях из 100 оно составляет 1,2-1,6мкг/мл. После лечения концентрация h18 уменьшается до уровня среднего значения. Больной К., 14лет, обследован по случаю воспаления неизвестной этиологии. Наряду с установлением агентов бактериального воспаления был обнаружен маркер H.pylori в количестве 1,3мкг/мл в моче. Язвенная болезнь подтверждена традиционными методами и проведено лечение в течение двух месяцев. Повторный анализ методом ГХ-МС показал содержание h18 равное 0,4мкг/мл, т.е. в пределах среднестатистической нормы.

В отличие от других известных способов диагностики инфекции и дисбиозов, ГХ-МС метод экспрессен и универсален в отношении различной микрофлоры, не требует прекультивирования пробы, а также использования специфического биологического тестового материала: ферментов, сывороток, меток, питательных сред, экспериментальных животных и т.п. В анализе используются химические реактивы и аппаратура, общеупотребимая при хромато-масс-спектрометрическом рутинном анализе.

Методика

Осажденные центрифугированием пробы из 3 мл мочи с 1 мл супернатанта экстрагировали в смеси 2,5 мл метанола и 0,8 мл хлороформа. Полученный таким образом экстракт липидов осаждали с хлороформом в результате разделения фаз растворителей при добавлении 0,2мл воды и такого же количества хлороформа. Хлороформ отделяли, упаривали досуха при 80⁰С, осадок подвергали кислому метанолизу в 400 мкл сухого 1М хлористого водорода в метаноле при 80⁰С в течение 1час. Фракцию полученных таким образом метиловых эфиров жирных кислот, оксикислот, жирных спиртов, стеринов и других липидных мономеров извлекали из реакционной смеси двумя порциями гексана по 0,2 мл. Объединенный экстракт высушивали и обрабатывали 0,02 мл силилирующего агента - бис-(триметилсилил)-трифторацетамида (БСТФА) для получения летучих производных оксикислот, спиртов и стеринов. Полученную пробу анализировали на хромато-масс-спектрометре в режиме масс-фрагментографии.

1. Осипов Г.А. Демина А.М. Хромато-масс-спектрометрическое обнаружение микроорганизмов при анаэробных инфекционных процессах. Вестник РАМН. -1996, Т.13,-№2,- С.52-59.
2. Geis G., Leying H., Suerbaum S., Opferkuch W. Unusual fatty acid substitution in lipids and lipopolysaccharides of Helicobacter pylori. J.Clin.Microbiol. 28(5), 930-932, 1990.