Панорамный анализ микрофлоры при простатите и мужском бесплодии

Заболевания урогенитальной сферы мужчин - уретрит, простатит, орхит до сих пор занимают важное место в проблеме здоровья и продуктивности человека. На рубеже нового тысячелетия проблема простатита требует нового осмысления и вызывает необходимость поиска рациональных подходов к его диагностике и лечению. Острый и хронический бактериальный простатит занимает два первых места в классификации простатитов Нацинального института здоровья США. Доля инфекционного простатита при этом растет в хронологическом порядке и в настоящее время составляет до 70% - 90% по оценкам разных лабораторий. Однако определение возбудителя, а тем боле микст-инфекции при простатите (уретрите, орхите, мужском бесплодии) представляет проблему при клиническом или амбулаторном бактериологическом обследовании. Многие микроорганизмы, например, анаэробы и другие трудно культивируемые (коринеформы, микобактерии, микроскопические грибы) избегают детектирования современными методами клинической микробиологии. Их присутствие в семени и жидкости простаты становится известным лишь благодаря уникальным научным исследованиям, доступным специализированным научным лабораториям. Результатом являются, соответственно, единичные публикации в научной периодике. В изязвлениях мужских половых органов найдены аэробные и анаэробные бактерии, Mycoplasma, Нaemophilus ducrey, Treponema pallidum, Herpes simplex virus, дрожжи и нитчатые грибы. В семени мужчин, страдающих бесплодием, обнаружены E.coli, Staphylococcus, Pseudomonas, Klebsiella, Enterobacter, Bacillus, Neisseria, Corinebacterium, Micrococcus, Proteus, Achromobacter, а также микроскопические грибы. Электронно-микроскопические исследования выявляют простую причину нарушения функции оплодотворения - обрастание микроорганизмами жгутика сперматозоидов и снижение их пожвижности. При инфекционном простатите в разных исследованиях выявлены представители семейства Enterobacteriaceae, бактерии рода Pseudomonas, энтерококки (Enterococcus faecalis, E.faecium и другие), Staphylococcus aureus, Chlamydia trachomatis, Corynebacterium, Staphylococcus, Peptostreptococcus, Streptococcus, and Escherichia, Flavobacterium spp., Pseudomonas testosteroni. Исследование ДНК секрета и биоптатов простаты свидетельствует о наличии в них микроорганизмов, отличающихся от микробиоты кожи и прямой кишки, и, следовательно, не обнаруживаемых традиционными методами. Действительно, генетическим методом удалось определить в семени наличие 15 видов необычных анаэробов родов Peptostreptococcus, Prevotella, Corynebacterium, Rubrivirax, Actinobacillus, Veilonella и Eubacterium, а также трех аэробов: Streptococcus salivarius, S.pneumoniae и Burkholderia picketii. Как неожиданность воспринимается обнаружение в секрете простаты превалирующего количества недектируемых в обычной клинической практике коринеформных бактерий, причем в сложном сообществе с Staphylococcus, Peptostreptococcus, Streptococcus и Escherichia, состав которого различен у разных пациентов. Кроме того, обнаружены микробные ассоциации и у здоровых мужчин, однако иные, чем у больных и в меньшей концентрации. Следует отметить важное для диагностики инфекции обстоятельство, которое состоит в том, что микробные колонии могут быть локализованы в полисахаридных капсулах. Как показали электронно-микроскопические исследования, они покрывают стенки простаты и протоки при хроническом бактериальном простатите.

В таких случаях бактерии не могут выходить из капсулы и, следовательно, быть обнаружены методами, использующими выделение целых микроорганизмов. Однако их присутствие можно выявить и количественно оценить путем детектирования микробных маркеров - малых молекул, составляющих материал клеточной стенки микроорганизмов - бактерий, грибов, простейших, метаболитов вирусов в семени или секрете простаты. Тканевые, клеточные и капсульные барьеры не являются преградой для таких молекул - они, в отличие от микробных клеток, свободно их проходят и могут измерены методом газовой хроматографии в комбинации с масс-спектрометрией (ГХ-МС), который представлен ниже.

Обширная колонизация генитальных органов и мочевыводящих путей предполагает множественность бактериальных агентов воспалений. Ясно, что успех лечения заболеваний микробного происхождения зависит от эффективности диагностики инфекции. Однако методы микробиологического анализа, применяемые в клиниках и медицинских центрах, позволяют одновременно определять один или несколько организмов из более чем тысячи видов, агентов внешней инфекции или колонизирующих организм человека и являющихся потенциальными патогенами.

Уникальные возможности в этом отношении дает метод ГХ-МС. В отличие от других методов он является количественным, т.е. позволяет определять точно и воспроизводимо во времени количество микробных клеток каждого из микроорганизмов, колонизирующих генитальные органы. Сотни измерений концентрации микробных маркеров, проведенные нами в норме и при воспалительных процессах в генитальных органах, при соответствующей статистической обработке современными методами, позволили определить клинически значимые концентрации маркеров. Это дает возможность фиксировать переход соответствующего микроорганизма из состояния симбионта в состояние патогена и применить к нему методы антимикробной терапии. По порядку величины уровень клинически значимых (патогенных) концентраций маркеров соответствует известным измерениям и составляет 10⁴-10⁵ клеток в пробе.

Достоверность отнесения данных маркерного анализа подтверждена отличием состава микроорганизмов в норме и патологии, корреляцией с клиникой патологических отклонений, уменьшением (до нуля или нормального значения) концентраций маркеров патогенов в результате лечения антибиотиками, а также адекватностью состава микроорганизмов УГТ, определенного методом маркеров и известного (по литературным данным). Предложенный метод перспективен вследствие его экспрессности (определение всех маркеров в одном цикле анализа за 5 часов), прямой количественной связи концентрации маркера с количеством микроорганизмов, отсутствия необходимости культивирования пробы, независимость от физиологических, биохимических и прочих факторов, препятствующих традиционной культурально-биохимической и молекулярной диагностике ряда условно-патогенных микроорганизмов - комменсалов человека.

В результате десяти лет научных исследований и восьми лет практического применения метода сформирована база данных по 75 маркерам более чем 450 видов микроорганизмов (большинство из них считается недектируемыми), а также разработана программа их экспрессного количественного определения методом ГХ-МС непосредственно в пробе семени, мочи (и любых других биологических жидкостей). Из практически важных микроорганизмов за пределами возможностей метода остаются (пока не найдены маркеры): вирусы (кроме герпеса и энцефалита), уреплазмы, микоплазмы, гарднерелла, мобилункус, трихомонада и некоторые другие.

Нами описаны примеры обнаружения микроорганизмов в экологических пробах и при инфекционных процессах этим методом, в том числе для анализа микрофлоры вагинального содержимого и эякулята, а также контроля маркеров микроорганизмов в крови при перитоните, зндокардите, респираторных заболеваниях и системных воспалениях неизвестной этиологии. Метод защищен четырьмя патентами. Выпущено под эгидой Центрального научно-исследовательского кожно-венерологического института пособие для врачей по бактериальной диагностике этим методом. Опубликованы научные статьи в российских и зарубежных изданиях. Принцип и примеры использования метода ГХ-МС микробной диагностики представлены в интернет на Русском медицинском сервере
www.rusmedserv.com/microbdiag и www. rusmedserv.com/microbdiag/eng
соответственно на русском и английском языках. Разработчик д.б.н. Осипов Георгий Андреевич, тел. 254-67-40

Примеры

Нами проведен анализ состава микробных маркеров биологических жидкостей УГТ более ста пятидесяти пациентов уролога и сексопатолога. Примеры 1-4 и рис. 1-9.

Пример 1.

Состав микрофлоры генитальных органов при простатите по данным количественного определения микробных маркеров в эякуляте методом газовой хроматографии в комбинации с масс-спектрометрией (ГХ-МС). Проба SF-106.

Комментарий. Проверено 75 маркеров, охватывающих 450 видов микроорганизмов инфицирующих и колонизирующих организм человека. Обнаружены маркеры энтерококков и гонококка, отсутствующие в норме. Из комменсалов (бактерий, колонизирующих генитальные органы в норме) превышают клинически значимый уровень (1,5 межквартильных расстояния функции распределения) представители семейства Enterobacteriaceae и коринеформные бактерии (рода Corinebacterium - группы С.betae, C.oortii; а также родов Curtobacterium, Brevibacterium). Таким образом имеет место смешанная инфекция из четырех групп бактерий, последняя из которых считается недиагностируемой в клинической практике, но актуальная в заболевании простатитом. Подробные данные о составе микрофлоры, которые дает метод ГХ-МС, создают перспективу вылечивания в сложных случаях при адекватной антибиотикотерапии.

Пример 2 Мужское бесплодие. Состав микрофлоры генитальных органов по данным количественного определения микробных маркеров в эякуляте методом газовой хроматографии в комбинации с масс-спектрометрией (ГХ-МС). Проба SF-141.

Комментарий. Случай характеризуется резким снижением концентрации микроорганизмов, составляющих нормальную микрофлору мужских генитальных органов. Нарушение микробного гомеостаза - дисбактериоз. При этом превышают клинически значимый уровень численности содержание маркеров эпидермального стафилококка, бактерий рода Serratia, а также Corynebacterium (C.urealyticum в данном случае) и Streptomyces. Последние два рода не диагностируемы в клинической практике. С этим, видимо, связаны предыдущие неудачи пациента в лечении и его обращение к ГХ-МС диагностике через сеть интернет.

Пример 3. К нам часто обращаются пациенты с неустановленной микробной этиологией заболевания. Нередко оказывается, что его причиной является чрезмерное развитие актиномицетов

Комментарий. В значительной концентрации обнаружены 10-метил-разветвленные кислоты, которые характерны для актиномицетов родов Streptomyces, Microtetraspora, Planomonospora, Actinomadura. Завышена концентрация маркеров коринеформных бактерий (Corinebacterum betae и др.) и бактерий сем. Enterobacteriaceae.

Маркер Streptomyces, одного из основных микроорганизмов группы актиномицетов, отслеживается нами давно (рис.1).

Рис.1. Точечная диаграмма распределения концентраций изо-гексадекановой кислоты - маркера бактерий рода Streptomyces в эякуляте мужчин. Область клинической значимости выше ординаты 12. Это означает, что переход стрептомицетов в состояние патогенности происходит не так часто - 10 на 160 (из числа пациентов уролога), однако их доля может быть значительной в числе “неизлечимых” случаев простатита. Эта неизлечимость условна и происходит от недостатка диагностики или устойчивости стрептомицетов к большинству традиционно применяемых антибиотиков. Они сами являются их продуцентами, и, до уровня обозначенной здесь клинической значимости, полезны для организма человека. Содержание репера - гептадекановой кислоты (17:0), относительно которой построен график, - составляет 20мкг/мл эякулята (100 единиц по оси ординат).

Чаще клинически значимых величин достигает маркер бактерий сем. Enterobacteriaceae (наиболее вероятно, Serratia) (рис.2). Именно эти бактерии обычно обнаруживаются при обследовании бактериологическими методами.

Рис.2. Точечная диаграмма распределения концентраций цис-вакценовой кислоты - маркера Enterobacteriaceae (наиболее вероятно, Serratia) в эякуляте мужчин. Область нормы ограничена ординатой 10.

Значительно реже производится контроль анаэробов – обитателей кишечника человека. Как показывают наши исследования, концентрация их маркеров довольно часто попадает в область клинической значимости (рис.3 и 4). Учитывая значение, которое уделяют, и небезосновательно, анаэробам при воспалительных процессах, не стоит пренебрегать их чрезмерным присутствием в столь деликатном органе.

Рис.3. Точечная диаграмма распределения концентраций 10-гидрокси-октадекановой кислоты - маркера Clostridium perfringens в эякуляте мужчин. Область нормы ограничена ординатой 2.

Рис.4. Точечная диаграмма распределения концентраций b -гидрокси-гептадекановой кислоты - маркера Bacteroides fragilis в эякуляте мужчин. Нормальные значения - нулевые.

Крайне проблематична ранняя диагностика туберкулезного простатита в клинической лаборатории. Методом ГХ-МС позволяет выявить микобактерии (в том числе туберкулезные) по наличию их специфического маркера - туберкулостеариновой кислоты (рис.5).

Рис. 5. Распределение концентраций туберкулостеариновой кислоты в эякуляте пациентов с различными заболеваниями. Уровень 0,7 по результатам статистической обработки является верхней границей распределения в норме. Данные выше этого уровня возможно связаны с наличием микобактерий туберкулеза.

Но, как оказалось, наиболее часто при обследовании пациентов уролога - мужчин с проблемами генитальных органов – выявляются гонококк и хламидии. Причем наличие гонококка не сопровождается клиникой гонореи. Т.е. имеет место скрытая хроническая форма инфекции, не обнаруживаемая при бактериоскопии мазка и трудно поддающаяся лечению. Метод ГХ-МС позволяет проводить не только первичную диагностику, но и контроль эрадикации (полного удаления) возбудителя в процессе лечения.

Рис.6. Точечная диаграмма распределения концентраций b -гидрокси-додекановой кислоты - маркера Neisseria honorrhoae (гонококк) в эякуляте мужчин. Нормальные значения - нулевые.

Рис 8. Точечная диаграмма распределения концентраций b -гидрокси-изо-эйкозановой кислоты - маркера Chlamydia trachomatis в эякуляте мужчин. Нормальные значения - нулевые.

Существенная доля случаев инфекции при простатите и орхите связана с наличием стрептококковой инфекции (рис.9).

Рис.9. Точечная диаграмма распределения концентраций декановой кислоты - маркера оральных стрептококков в эякуляте мужчин. Нормальные значения - нулевые.

Пример 3. Лечение хронической гонококковой инфекции.

К-мов, до лечения, проба SF-800

Комментарий. При первом анализе обнаружена b -гидрокси-додекановая кислота - маркер гонококка (Neisseria на диаграмме), ассоциированного с преобладающим количеством бактерий семейства Enterobacteriacea. Других отклонений от нормы не обнаружено. Проверено 75 маркеров, охватывающих 450 видов микроорганизмов инфицирующих и колонизирующих организм человека.

Не детектируются данным методом: вирусы (кроме герпеса и энцефалита), уреплазмы, микоплазмы, гарднерелла, мобилункус, трихомонада и некоторые другие микроорганизмы.

К-мов,после лечения

После проведения адекватного лечения профиль микроорганизмов пришел в норму. Маркер гонококка (Neisseria на диаграмме) не обнаруживается, количество энтеробактерий ниже верхнего значения нормы. Есть превышение количества стафиллококка, но оно не является клинически значимым (укладывается в 1,5 межквартильных расстояния функции распределения)