Обнаружение  компонентов клеточных стенок актиномицетов («лучистых грибков») в клинических пробах

В систематике микроорганизмов актиномицеты относят к бактериям на основании строения клетки. Однако из-за способности клеток образовывать цепочки и формировать воздушный мицелий над поверхностью колоний их ошибочно причисляют к микроскопическим грибам и называют «лучистыми грибками». Атиномицеты относятся к трудно диагностируемым методами традиционной клинической диагностики микроорганизмам и поэтому редко фигурируют в качестве агентов инфекции или воспаления. Тем не менее они являются участниками многих воспалительных процессов в организме человека. Российскими учеными-медиками  (Минскер О.Б., 1967; Макаруха И.А., 1961; Лозинский Д.А.,1961; Сутеева Т.Г., 1969) был опубликован ряд научных работ по актиномикохзу желудочно-кишечного тракта, ротовой полости, респираторных органов, женских половых органов и пр.

С ними связаны такие серьезные заболевания, как туберкулез, нокардиозы и актиномикозы. Более поздние результаты обобщения Отделения микозов Центра по контролю заболеваний в Атланте (США), подтверждают участие актиномицетов родов Streptomyces, Nocardia, Actinomadura, Rhodococcus, Nocardiopsis, Pseudonocardia и других при респираторных заболеваниях, эндокардите, уретрите а также при раневых и травматических инфекциях [McNeil, 1994; McNabb, 1997]. Полные ссылки на работы указанных здесь и далее авторов специалисты могут получить, обратившись по электронной почте к Осипову Г.А. (osipovga@rusmedserv.com).

Для клинической диагностики трудно культивируемых микроорганизмов используются экспрессные молекулярные методы, в том числе газовая хроматография (ГХ) [Weiant, 1999] и ее сочетание с масс-спектрометрией (ГХ-МС) [см. другие материалы и ссылки «Микробной диагностики»]. Известно использование этих методов для детектирования микобактерий, в первую очередь, туберкулеза по туберкулостеариновой кислоте (ТСК), фрагментам миколатов и специфичным жирным спиртам [Larsson L.]. Нами в программу скрининга включены, наряду с ТСК, другие маркеры группы актиномицетов - 10-метилразветвленные кислоты с числом атомов углерода  от 14 до 17, изопальмитиновая кислота и другие. Их мониторинг в клиническом материале (кровь, моча, ликвор, слюна, мокрота, вагинальное содержимое, эякулят, биоптаты кишечника, ткань клапана сердца, атеросклеротические бляшки) обнаружил присутствие этих маркеров в норме, увеличение их концентрации в патологии, ответ на адекватную антибиотикотерапию, что еще раз подтверждает колонизацию организма человека актиномицетами участие их в микст-инфекции.

Поскольку концентрация маркера микроорганизма пропорциональна числу его клеток, то оно определяется по простой формуле пропорциональной зависимости с учетом калибровки по соответствующим стандартам. В данном случае – однажды измеренному составу жирных кислот в клетках целевых микроорганизмов и вводимой при анализе дейтерированной тридекановой кислоте. Из этого следует, что метод микробных маркеров является количественным и позволяет точно определять число практически любых микроорганизмов в очаге воспаления или оценивать их эффективное количество, когда маркеры определяются по крови, моче или ликвору, где присутствуют не сами микробы, а поступающие в жидкость продукты их естественного распада или уничтожения фагоцитами.

Таким образом по концентрации маркеров было определено,  что до 50% микроорганизмов пристеночной микрофлоры тонкой кишки составляют актиномицеты (Осипов Г.А., 2001; см. раздел Дисбактериоз на этой странице Русмедсервера) . Причем их концентрация существенно меняется при заболеваниях,  которые причинно-следственным образом связаны с составом микрофлоры кишечника. Это в первую очередь кишечные патологии: синдром раздраженного кишечника, различные диареи. Существенные изменения концентрации маркеров актиномицетов в тонком кишечнике обнаружены при болезни Крона, язвенных колитах и кахексии. Оказалось, что их содержание в крови существенно меняется при дерматитах: экземе, псориазе, угреватости кожи лица, крапивнице, себорейном и атопическом дерматитах, что позволяет развивать новые версии в происхождении или развитии этих заболеваний. Поскольку культивирование актиномицетов доступно лишь специализированным лабораториям, их диагностика в клинических бактериологических службах фактически отсутствует. В результате оказывается, что значительная доля лихорадок неизвестной этиологии, не поддающихся лечению вагинитов, простатитов, уретритов, менингитов, эндокардитов, респираторных заболеваний, а также упоминавшихся выше кишечных патологий и дерматитов, связано с участием актиномицетов. Пациенты, прошедшие диагностику по методу масс-спектрометрии микробных маркеров имеют возможность установить наличие клинически значимых отклонений в содержании актиномицетов а затем получить консультации по лечению у врачей различного уровня и специализации, которые активно используют этот метод в своей практике.

Ниже приводятся некоторые конкретные клинические случаи.

1. Перикардит. Выявление  спектра веществ, количественно отвечающего стрептомицетам. Подтверждение лечением.

 Пробы крови больного Д. с диагнозом перикардит ассоциированный с плевритом,  госпитализированного в НЦССХ  РАМН, отбирали венепункцией в процессе лечения. Однократно взята пункция плевральной жидкости. Бактериологическое исследование проб проводили по методике посева на жидкую питательную среду во флаконы системы BACTEC и методом газовой хроматографии – масс спектрометрии (ГХ-МС) микробных маркеров. В результате посева выявлен стрептококк как в крови, так и в плевральной жидкости. Его маркеры были обнаружены также в этих жидкостях методом ГХ-МС.

Кроме этого, обнаружена необычно высокая концентрация разветвленных (изо- , антеизо- и 10Ме-) кислот, особенно изо-гексадекановой, i16. Последняя встречается в клетках многих микроорганизмов, но наиболее вероятно и в относительно большом количестве она содержится у бактерий родов Bacillus и Actinomyces. При анализе всего спектра  разветвленных кислот он совпал с большой достоверностью с профилем  ЖК штамма Streptomyces AU10. Их диаграммы приведены на рис 1. На втором месте по степени корреляции оказался клинический штамм Streptomyces albus, полученный нами из Центра глубоких микозов (Москва).  Изменение концентрации изопальмитиновой кислоты (а следовательно, пропорционального ей количества стрептомицетов) прослежено в процессе лечения больного (вместе с другими маркерами). Всего заболевание имело продолжительность 10 недель. На первоначальной стадии 8,5 недель примененная антибиотикотерапия в отношении стрептококков а также другие меры, успеха не имели. Концентрация маркеров стрептомицетов и альфа-стрептококков оставалась на уровне, в десятки раз превышающем норму. Активная стадия вылечивания наступила лишь в последнюю декаду перед выпиской, когда был назначен амикацин, выбранный на основании результатов испытаний на антибиотикочувствительность клинических штаммов стрептомицетов в Центре по контролю заболеваний (Атланта, штат Джорджия, США) [McNeil, 1994].  В течение пяти дней клинические показатели и концентрация маркеров стрептомицетов и стрептококков пришли в норму, больной был выписан. С декабря 1999 года по настоящее время (сентябрь 2001г.) рецидивов заболевания не было.

Рис.1. Совпадение профилей группы разветвленных жирных кислот в крови пациента с профилем ЖК чистой культуры Streptomyces свидетельствует об участии стрептомицетов в воспалительном процессе при перикардите. Насколько специфична эта корреляция можно представить, если иметь в виду, что примерно половина царства бактерий не синтезирует вообще разветвленных кислот, подавляющее большинство из синтезирующих имеют в составе мембраны только нечетные разветвленные кислоты. Это стафилококки, бактерии родов Butirivibrio, Bacillus, Prevotella, Propionibacterium, Corinebacterium, Bacteroides, Nocardia и другие. Четные разветвленные кислоты из микроорганизмов клинического значения синтезируют представители небольшого числа родов, в том числе стафилококки, Streptomyces, Bacteroides, Micromonospora, Brevibacterium, Maduromycetes, Corinebacterium группы С.betae, Curtobacterium, Oerscovia, Cellulomonas. Однако из тех, у которых основной ЖК в профиле является изопальмитиновая, нам известны лишь виды Streptomyces.

2. Синхронное обнаружение микробных маркеров в мокроте и крови при бронхите

Молодая женщина с шестилетней историей хронического бронхита обратилась на предмет диагностики в период обострения болезни при следах крови в мокроте. При бактериоскопии мокроты обнаружены мицелий-подобные образования. Компьютерная томография выявила обширный абсцесс в правой верхней доли легкого. ГХ-МС метод был применен для анализа микробных маркеров в мокроте и крови больной, отобранной венепункцией. В мокроте обнаружено десятикратное в сравнении с нормой превышение концентрации маркеров изо-гекадекановой кислоты – маркера Streptomyces. В крови ее концентрация оказалась увеличенной вдвое. В мокроте обнаружены также клинически значимые превышения маркеров Staphylococcus intermedius  и Clostridium perfringens. При этом не обнаружены Aspergillu и другие микроскопческие грибы, производящие эргостерол, ввиду его отсутствия в пробах. Маркер Candida albicans не превышал клинически значимого уровня. В связи с этим, логично предположить, что мицелиальные формы относятся к стрептомицетам. Другие актиномицеты не были обнаружены ввиду отсутствия маркера микобактерий – туберкулостеариновой кислоты (в том числе и микобактерий туберкулеза),  родококков – туберкулопальмитиновой кислоты, нокардий (туберкулостеариновая и 11,12-тетрадеценовая кислоты), а также других 10-метил-разветвленных кислот (микромоноспора, актиномадура). В посеве мокроты были обнаружены только стафилококки. Посев крови – отрицателен.

В крови обнаружено превышение большего числа маркеров, по сравнению с мокротой (Табл.1). Это означает, что анаэробный пептострептококк, пневмококк, золотистый стафилококк, пропионобактерии и флавобактерии заключены во внутренней части биопленки микроорганизмов и не попадают в заметной степени в мокроту. При этом компоненты этих микроорганизмов, погибающих естественным путем или в следствии фагоцитоза выводятся из организма через кровь. В связи с большим числом серьезных патогенов был применен антибиотик широкого спектра действия дифлюкан. В результате лечения были сняты клинические симптомы, а рентгеноскопически абсцесс в легких перестал обнаруживаться.

Состав условно-патогенной микрофлоры, выявленной методом хромато-масс-спектрометрии по микробным жирным кислотам в мокроте и венозной крови больного хроническим бронхитом в период обострения заболевания. Жирным шрифтом выделены клинически значимые превышения нормы. Данные в эффективном количестве клеток, пропорциональном концентрации маркера 

Таблица 1

* calc - рассчитано по остатку

3. Маркеры актиномицетов в ткани клапана сердца

При изучении материала пораженного клапана сердца при операции волвэктомии у некоторых больных обнаружены высокие концентрации маркеров стрептомицетов. Такой случай – стрептомицетного эндокардита - известен из литературы [Mossad S.B., 1995]. Следует обратить внимание, что в данном случае наши измерения проводились непосредственно в материале, где микроорганизмы живут и размножаются, поэтому данные маркерного анализа относятся непосредственно к живым микроорганизмам (продукты их распада уносятся кроветоком). Профиль разветвленных жирных кислот, специфических для актиномицетов (рис.2), как и в предыдущем примере близок к составу жирных кислот бактерий рода Streptomyces, штамм AU10.

4. Родококки и другие актиномицеты при простатите

К нам часто обращаются пациенты с неустановленной микробной этиологией заболевания. Нередко оказывается, что его причиной является чрезмерное развитие актиномицетов. Наиболее часто обнаруживаются родококки (рис.3) по превышению нормы содержания туберкулопальмитиновой кислоты (10Ме16). Как правило, они ассоциированы с альфа-стрептококками, иногда с другими микроорганизмами: стафилококками, гонококком, кишечной палочкой, герпес-вирусом, кандидой и другими.   

Рис.3. Случай абсолютного преобладания родококков в эякуляте больного простатитом. Уровень клинической значимости (превышение нормы более чем в два раза) превышают также маркеры коринеформных бактерий. Последние, наряду с актиномицетами, являются недавно выявленными агентами инфекционного простатита, но еще не вошли в практику диагностики в клинических лабораториях и диагностических центрах.

4. Актиномицеты при вагинальном дисбиозе и бесплодии

В последнее время мы обнаружили маркеры и стали диагностировать большую группу бактерий - актиномицетов, которые, как оказалось, составляют значительную долю микрофлоры человека, в том числе его половых органов. Это было известно и ранее из работ профессора Минскера О.Б., руководителя клиники глубоких микозов в восьмидесятые годы прошлого (уже) века, но не нашло отражения в практике диагностики и лечения инфекций урогенитальных и других органов. Наш опыт позволяет полагать что в ряде случаев причиной бесплодия у женщин является избыточная по сравнению с нормой колонизация слизистой половых органов микроорганизмами, способными повредить уже оплодотворенную яйцеклетку. Большинство из них относятся к "невидимкам" для культурально-биохимических методов и ПЦР, а тем более, микроскопии мазка. Это хронический гонококк, локализованный в верхних отделах, многочисленные анаэробы (клостридии, эубактериум, пептострептококки, фузобактерии, гемофильная палочка и др), актиномицеты (стрептомицеты, нокардии, микобактерии, родококки и др.), нетривиальные грамотрицательные микроорганизмы (моракселлы, псевдомонады, ацинетобактер) и микроскопические грибы.

Можно полагать, что чрезвычайно низкая вероятность успеха ЭКО (15-35% в различных центрах) связана с тем, что зародыш помещается в грязное место, - ее просто "съедают" микробы. Возможно, актиномицеты выполняют именно такую роль, так как по данным исследований Марии Андерссон (Финляндия) патогенные штаммы бактерий рода Streptomyces, обнаруживаемые на стенах сырых помещений, выделяют токсин валиномицин, поражающий митохондрии клеток человека и тем самым вызывающий эффект некротизации тканей.

Ниже приводится пример гонококкового (Neisseria) вагинита при наличии актиномицетов рода Streptomyces  и анаэробной инфекции.

Рис.4. В вагинальном содержимом обнаружен гонококк (Neisseria) при наличии бактерий рода Streptomyces (актиномицеты), грамотрицательной (Bacteroides fragilis, B.urealyticum, Prevotella melaninogenica) и грамположительной (анаэробный пептострептококк и пропионобактерии) анаэробной инфекции. Лечение проводилось постадийно доктором Столяровой О.Н. (гонококк, анаэробы, актиномицеты). Повторное обследование показало нормализацию микрофлоры. Беременность наступила естественным путем.

Banners Exchange System 'Flamingo'