Осипов Г.А., Парфенов А.И., Богомолов П.О.
Научный центр сердечно-сосудистой хирургии, Академическая группа Академика РАМН Ю.Ф. Исакова
Центральный НИИ гастроэнтерологии

Сравнительное хромато-масс-спектрометрическое исследование состава химических маркеров микроорганизмов в крови и биоптатах слизистой оболочки кишечника

Резюме

Методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии определены жирные кислоты - маркеры микроорганизмов в крови и биоптатах тощей, подвздошной и толстой кишок пациентов с синдромом раздраженного кишечника. Обнаружены маркеры Cl. perfringens, Cl. difficile, Enterococcus, Streptomyces, Enterobacteriaceae, Bacteroides fragilis, Eubacterim, Helicobacter pylory, Klebsiella, E. сoli, Peptostreptococcus, Candida albicans, родов Streptococcus, Staphylococcus, Fusobacterium sp. и других микроорганизмов. Определена заселенность слизистой оболочки кишечника, которая оказалась по порядку величины одинаковой для тощей, подвздошной и толстой кишок  (0,5 - 1,3) ´ 10¹⁰ кл/г, и лишь на порядок меньше измеренной в параллельном эксперименте концентрации микробов в фекалиях (1,8 ´ 10¹¹ кл/г).  В большинстве случаев отмечена корреляция состава маркеров в крови и биоптатах, представляющих среду обитания этих организмов. Обсуждается возможность использования специфичных жирных кислот в качестве маркеров микроорганизмов при предварительной диагностике изменений микрофлоры слизистой оболочки кишечника по составу минорных жирных кислот в крови.

Введение

Химические методы дифференциации микроорганизмов находят все большее применение и оказываются нередко более быстрыми и универсальными [18,19]. Наиболее широко для этих целей используется газовая хроматография (ГХ) и газовая хроматография в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ-МС), которые позволяют получить уникальную информацию о составе мономерных химических компонентов микробной клетки и метаболитов [15]. Маркеры такого рода могут быть определены и использованы для детектирования микроорганизмов [39]. Различные приложения метода химического маркера приведены в обзоре S. Morgan [28]. Хемодифференциация широко используется как метод идентификации и подтверждения таксономического положения микроорганизмов. Он используется для работы с микроорганизмами, изолированными в чистых культурах и основан на использовании очень больших баз данных, содержащих сведения о составе жирных кислот нескольких тысяч штаммов бактерий и микроскопических грибов. Примером такой системы является специализированный хроматограф Microbial Identification System, выпускаемый фирмой MIDI Inc., Делавер, США [34]. Особенности состава жирных кислот теперь используются наряду с другими параметрами в бактериальной таксономии [2] и клинической бактериальной диагностике [39].

Возможности детектирования микроорганизмов методом ГХ-МС по их маркерным веществам, в том числе жирным кислотам, в области практической медицины мало изучены. Известны попытки обнаружения бактерий по мурамовой [21] и  b-оксимиристиновой [ё14] кислотам в крови. Предложены диагностика видов Haemophylus по специфическим оксикислотам [15], дифференциация видов Campylobacter [19], контроль менингококка по наличию b-оксилауриновой кислоты в крови [14] и гонококка по одновременному присутствию b-оксилауриновой и b-оксипальмитиновой кислот [35].

Ранее нами описаны примеры обнаружения микроорганизмов при инфекционных процессах методом ГХ-МС [3,4].  Установлено наличие гомеостаза малых молекул микробного происхождения в крови человека, который нарушается при воспалениях [1, 13].

В настоящей работе предполагалось оценить, насколько данные анализа методом ГХ-МС микробных маркеров могут быть использованы для контроля  состава микрофлоры в биоптатах слизистой оболочки  кишечника. Предполагалось также  сопоставить эти результаты с анализом минорных липидных компонентов в крови того же больного. Это позволило бы получить данные о проникновении микробных компонент из местообитания мукозной микрофлоры в кровоток и уточнить диагностическую значимость определения маркеров потенциально опасных микроорганизмов  в крови и биоптатах.

Материалы и методы

Образцы проб. Изучали пробы крови и биоптаты слизистой оболочки тощей, подвздошной и ободочной кишок, полученные у 14 больных с синдромом раздраженного кишечника (СРК) с преобладанием поносов. Биоптаты получали во время интестиноскопии и колоноскопии с ретроградной илеоскопией. Контрольную группу составили 3 добровольца из числа призывников на военную службу. Образцы проб обрабатывали сразу после отбора. При невозможности немедленного анализа их консервировали в органических растворителях или  замораживали при -5^оС. 

Газовая хроматография - масс-спектрометрия. Цельную кровь в количестве 0,05 мл высушивали при добавлении метанола и подвергали кислому метанолизу в 1 М HCl в метаноле. Метанолиз сухого остатка, равно как биоптатов слизистой оболочки (последние в количестве 3-4 мг), проводили в 0,4 мл реактива в течение одного часа при 80°С. В результате реакции метанолиза жирные кислоты освобождаются в виде метиловых эфиров. Их двукратно экстрагировали 200 мкл гексана, высушивали и обрабатывали в 20 мкл N,О-бис(триметилсилил)-трифторацетамида в течение 15 мин при 80°С для получения триметилсилильных эфиров гидрокси-кислот. Смесь эфиров в количестве 1 мкл вводили в инжектор ГХ-МС системы HP-5973 Хьюлетт-Паккард (США) или QP-2000 Shimadzu (Япония). Для управления и обработки данных использовали штатные программы приборов. Хроматографическое разделение пробы осуществляли на капиллярной колонке с метилсиликоновой привитой фазой Ультра-1 Хьюлетт-Паккард. Длина колонки 25м, внутренний диаметр 0.25 мм. Режим анализа - программированый, скорость нагрева термостата колонки - 5 град/мин в диапазоне 130 - 320°С. Масс-спектрометр - квадрупольный, с ионизацией электронами (70эв) работал в режиме селективных ионов, или масс-фрагментографии (МФ), при периодическом сканировании от восьми до пятнадцати ионов в пяти интервалах времени. Интервалы и ионы выбирали таким образом, чтобы селективно детектировать маркеры определяемых видов микроорганизмов. В том числе использовали сильный ион m/z = 87 в спектрах жирных кислот (ЖК) для  детектирования малых количеств микробных кислот С12-С15, С17, С19, выбрав интервалы групп так, чтобы обойти интенсивные пики кислот С16 и С18, доминирующие в жирнокислотном профиле клеток организма человека. Ион 175 взят постоянно в каждом режиме для детектировани b-оксикислот, для которых он специфичен и интенсивен в спектре. Ионы 301, 315 и далее через 14 единиц массы- это свидетели (М-15) молекулярного иона оксикислот тридекановой, тетрадекановой и следующих в гомологическом ряду. Ион 312, как молекулярный, взят для выявления изомеров нонадекановой кислоты, важной для диагностики стафилококка и энтерококков. Такой алгоритм детектирования масс-спектральных параметров биологической пробы позволяет детектировать около двухсот известных ЖК, спиртов и стеролов микроорганизмов, что достаточно для выявления и количественного определения более 170 таксонов клинически значимых микроорганизмов на уровне рода или вида.

Площади пиков маркеров на масс-фрагментограммах интегрировали автоматически или вручную и заносили  данные в протокол. Затем эти данные вводили в программу расчета, подготовленную в электронных таблицах EXCEL. Для количественного расчета использовали данные калибровки по дейтерированной тридекановой кислоте и чистым культурам клинических изолятов микроорганизмов. Их связывали с концентрацией гептадекановой (маргариновой) кислоты, содержание которой постоянно в крови и тканях людей. Это позволяло впоследствии длительное время обходиться без повторных калибровок.

Расчет состава и количества эффективных клеток микроорганизмов. При составлении программы анализа, алгоритма идентификации и количественного расчета эффективного числа клеток компонентов микст-инфекции использованы сведения о химическом составе индивидуальных и коллективных маркеров  более 500 штаммов условно патогенных и патогенных микроорганизмов.

Анализ данных показал, что разные микроорганизмы имеют в сумме около 200 ЖК, отличающих их от клеток организма человека. При этом оказалось, что в группе клинически значимых микроорганизмов некоторые вещества соотносятся только с одним таксоном. Число клеток или вес таких микроорганизмов вычисляли  по концентрации вещества - маркера, используя известные данные по содержанию ЖК в микробной клетке, условиям пробоподготовки и калибровки прибора. Таким способом определяли эффективную (то есть соответствующую измеренной в данный момент концентрации маркера) численность бактерий видов Сl. perfringens, Cl. difficile, Bacteroides fragilis, Chlamidia trachomatis, грибов Candida albicans, бактерий родов Klebsiella, Eubacterium, Streptomyces, Nocardia, Flavobacterium, Pseudomonas, Enterococcus, Staphylococcus, сем. Enterobacteriaceae и других, а также неспецифически грибов по эргостеролу (Aspergillus, Mucor и др.). Некоторые бактерии и вирусы вмешиваются в синтез стеринов в клетках человека, что позволяет определять бактерии рода Eubacterium  по продукту трансформации человеческого холестерина ее ферментом в копростанол, вирусы герпеса неспецифически по индуцируемому ими метаболиту холестендиолу, цитомегаловирусы - по холестодиенону и изомерам холестадиена. Если вещество не обладает свойством маркера, то есть может быть отнесено к двум или более таксонам, то и в этом случае доля вклада каждого микроорганизма, если воспользоваться решением системы уравнений для двух (или, соответственно, более) веществ. Такой способ описан нами для расчета экологических микробных сообществ [7,33]. Результат расчета представляется в виде таблицы концентраций более 50 таксонов микроорганизмов, условных и абсолютных патогенов, которые наиболее часто проявляются при воспалительных процессах микробной этиологии. Они количественно характеризуют определенную часть микроорганизмов тела человека, маркеры которых в данный момент времени попадают в кровь. Не следует считать, что в крови присутствуют активные микробные клетки, тем более, что данные культуры крови обычно отрицательны. Наличие маркеров микроорганизмов в крови теоретически  обусловлено механизмом иммунного ответа на появление возбудителя. Фагоцитирующие клетки организма человека адсорбируют и переваривают  антигены микроорганизмов, в том числе и целые клетки, и выводят продукты лизиса в поток лимфатической и кровеносной систем. Можно представить, что поток лимфы, постоянно омывающий ткани, стенки кишечника и эпителий “ворот” инфекции, забирает антиген возбудителей хронической или острой инфекции. Сывороточные белки передают компоненты антигена фагоцитам, где запускается известный механизм по уничтожению антигена и пораженных клеток макроорганизма и выработка антител для последующих актов иммунной реакции. Для нас важно, что при этом компоненты микробных клеток попадают в кровь и могут быть определены в ней чувствительным аналитическим методом, каковым является метод ГХ-МС в режиме фрагментных ионов [4]. Кроме фагоцитоза, клетки микроорганизмов разрушаются под действием других механизмов, в том числе собственного аутолиза клеток и лизиса ферментами белкового комплемента крови и других компонентов иммунной защиты. В любом случае разрушение происходит в конечном счете до мономерных составляющих биополимеров. Исходя из основ физиологии обмена биологических жидкостей человека [8], обмен 70% жидкости плазмы с интерстиционным пространством происходит за 1 мин. Поэтому малые фрагменты микробных биополимеров, образующиеся в этом пространстве, поступают в кровь практически сразу. Если при этом учесть, что большая часть фагоцитирующих клеток крови (фагоциты) находится за пределами сосудистого русла, в межклеточном пространстве и свободно проходит стенки сосудов, то можно полагать, что независимо от очага воспаления микробные маркеры постоянно и быстро поступают в кровь вместе с фагоцитами и белками переносчиками. То есть наличие микробных маркеров в крови отражает состав микробных сообществ тела человека, независимо от места обитания микроорганизмов или очага воспаления. Интересно, что  в норме маркеры превалирующих в кишечнике  бактероидов, энтеробактерий, лактобацилл и бифидобактерий либо отсутствуют, либо выявляются в крови лишь в небольших количествах, что косвенно свидетельствует в пользу существующей точки зрения об относительной иммунологической толерантности к индигенным анаэробам, и, следовательно, низкой вероятности фагоцитоза этих микроорганизмов [1].

В пользу микробного происхождения ЖК и стеринов, не характерных для клеток организма человека, свидетельствуют следующие соображения и факты.

• Хорошо известно, что  в клетках млекопитающих  отсутствуют гидрокси, циклопропановые и нечетные ненасыщенные ЖК.
• В результате проведенных нами более 500 анализов биологических жидкостей человека и почти такого же количества образцов крови животных было определено, что динамичное изменение состава минорных ЖК свидетельствует об их экзогенном происхождении.
• Состав ЖК макроорганизма колеблется в пределах 25% от их среднего значения в разных пробах, а состав экзогенных соединений от 0 до максимума в случаях острого воспаления и статистически достоверно отличается от состава маркеров у здоровых доноров [13].
• При проведении антибактериальной терапии значения минорных компонентов в крови возвращались к нормальным [32].
• Концентрация микробных маркеров адекватна интенсивности воспалительного процесса (3-гидрокси-пальмитиновая кислота в крови как маркер Brucella  в случае экспериментального бруцеллеза у морских свинок, 72 - дневный курс [4].
• Концентрация микробных маркеров Salmonella в крови пациентов с сальмонеллезом кореллирует со значениями титров антител [4].
• Концентрация 10-гидроксистеариновой кислоты (маркер  Сl. рerfringens) пациентов с синдромом длительного сдавливания и диагнозом “газовая гангрена” коррелирует с наличием и количеством Сl. perfringens, подтвержденным культуральным методом [5].
• В многочисленных случаях нашей практики обнаружения анаэробной инфекции, связанной с появлением маркеров B. fragilis, P. anaerobius  в биологической жидкости, применение адекватной антибиотикотерапии приводит к их исчезновению после лечения.

Результаты и обсуждение

При ГХ-МС исследовании фракций ЖК в пробах крови и биоптатах обнаружено, что основными компонентами (на уровне относительного содержания более 1%)  являются четные  кислоты с 12 - 18 атомами углерода: С18:1, С16:0, С18:2, С18:0, С16:1 (в порядке уменьшения содержания в профиле ЖК), а также полиненасыщенные ЖК С20:n, С22:n, холестерин, альдегиды и 2-оксикислоты. Иногда величину 1% превышает содержание длинноцепочечных кислот С20 - С26. Нечетные кислоты - С15:0 и С17:0 составляют около 1%  каждая. Их содержание постоянно в биологических жидкостях  здоровых и больных людей, что позволяет использовать в качестве инварианта (внутреннего стандарта) при относительных измерениях.

Перечисленные выше вещества являются липидными компонентами клеток организма человека и составляют естественный фон, на котором в исследованных пробах выявлены минорные компоненты, не характерные для макроорганизма. Хроматограммы позволяют  уверенно детектировать микробные компоненты на фоне преобладающих компонентов слизистой кишечника. Большинство пиков целевых веществ свободны от наложения, достаточно дистанцированы от пиков субстрата и вследствие этого могут быть доступны для автоматического выборочного интегрирования по  штатной программе ГХ-МС системы. Площадь пика маркера пропорциональна его концентрации, а, следовательно, концентрации соответствующего микроорганизма, которая определяется как число клеток N₁ в единице объема или веса пробы по формуле:

N₁=Ai[Mst/(q2*Msam*Ast)]/Ri₁  , где выражение в квадратных скобках, постоянный коэффициент

к = Mst/q2/Msam/Ast = Mst(mg)/5,1x10(-15)g/Msam(mg)/Ast

В этих формулах Ai - площадь пика маркера, Mst - количество введенного в пробу стандарта в мг, Msam - соответственно, количество пробы, Ast - площадь пика стандарта, Ri₁ - доля в % маркера с индексом i в профиле ЖК определяемого микроба с номером 1 (N₁), q2 - коэффициент, равный 5,1x10^(-15)g , в котором содержится основополагающая в пересчете на число клеток величина 5,9х10¹² клеток микробов, содержащихся в 1г микробной биомассы и доля ЖК в клетке, принятая в среднем равной 3%.

Соответственно, число клеток любого следующего микроорганизма можно рассчитать по аналогичной формуле N₂ = Ai x k / Ri₂  и так далее, умножая площади пика  Ai маркера, по которому проводятся вычисления, на  коэффициент k и деля на долю маркера в % в составе ЖК этого микроорганизма.

Здесь мы не будем касаться случая, кода одна и та же ЖК происходит из клеток разных микроорганизмов и для разделения компонетов требуется использование более сложных расчетов.

Кровь 14 пациентов с СРК исследована на содержание 135 таких веществ, что дает информацию о 170 таксонах микроорганизмов. Одновременно аналогичным способом проведено их количественное определение в биоптатах. Как оказалось, концентрация маргариновой кислоты, которая использовалась в качестве инварианта при анализе микрофлоры в других органах, в тощей и толстой кишках составляет, соответственно 200 и 500 мкг/г биоптата, то есть на порядок больше, чем в крови и других биологических жидкостях.  Соответственно в разной степени, но также примерно на порядок увеличено содержание и других маркеров микроорганизмов. Перечень ЖК и стеролов, обнаруженных в пробах биоптатов, приведен в таблице 1 с отнесением к наиболее вероятным микроорганизмам, в клетках которых они встречаются. Стеролы и 10-оксистеариновая кислота относятся к метаболическим продуктам соответствующих микробов в организме человека. Их качественный состав идентичен минорным ЖК и стеролам крови.

Таблица 1. Список минорных липидных компонентов, найденных в биоптатах кишечника с отнесением к микроорганизмам, у которых они наиболее часто встречаются.

* -  Обозначения веществ: 17:1 - 17- число атомов углерода, цифра после двоеточия - число двойных связей; h - оксикислота; а,i - в начале означает разветвление; аlc - в конце символов - спирт, cyc - циклопропановая кислота. Например, ha17 - 3-окси-антеизогептадекановая кислота, 2h24alc - 2-окситетракозиловый спирт.

**-  имеется в виду 3-оксикислоты, если не указано положение гидроксила

Ниже приводится обоснование принадлежности маркеров конкретным микроорганизмам, предполагаемым обитателям стенки кишечника, а также характер изменения их концентрации в пробах и в сравнении с нормой.

Bifidobacterium. Известные данные по составу ЖК бифидобактерий не дают основания для выбора надежного маркера для их детектирования в составе микрофлоры кишечника. Причем специфика проявляется на штаммовом уровне. Здесь мы предприняли попытку измерить  их численность по компоненту специфического липида - плазмологена, который отличается включением альдегидов в состав глицеридов клеточной мембраны. Для бифидобактерий отличительным является октадеценовый альдегид [27], который и регистрировался в качестве меры их концентрации.

Lactobacillus. Лактобациллы имеют четкий маркер - лактобацилловую кислоту [37], которая встречается и у других бактерий, псевдомонад и некоторых энтеробактерий. Однако, псевдомонады редко обнаруживаются в кишечнике в заметных концентрациях, а перекрестное определение с энтеробактериями учитываются в уравнении баланса концентраций ЖК с использованием дополнительных маркеров. Для лактобацилл таковым является пальмитолеиновый альдегид (16:1а), компонент липида плазмологена [27].

Семейство Enterobacteriaceae. Энтеробактерии очень похожи по профилю ЖК, допускают родовую дифференциацию в чистой культуре клеток, но вряд ли различимы в целом при одновременном присутствии в сообществе микроорганизмов. Их маркеры b-оксимиристиновая кислота (h14), циклогептадекановая (17cyc) и цис-вакценовая (18:1D11) кислоты имеют ранг семейства, при многочисленных перекрестах с представителями других семейств. Здесь, при отсутствии псевдомонад реально оценивать количество энтеробактерий в целом по концентрации 17cyc.

Klebsiella. Клебсиеллы среди других членов семейства Enterobacteriaceae имеют отличительный признак - 2-оксимиристиновую кислоту (собственные измерения) в составе ЛПС, которая в данном сообществе оказывается маркером рода.

Eubacterium. Представители этого рода являются одними из основных обитателей кишечника. Их маркер, дегидрохолестерол (копростанол) является продуктом интерактивного метаболизма  Eubacterium и клеток организма-хозяина [29]. Он легко определяется хроматографически и используется в качестве маркера фекальных загрязнений окружающей cреды [31].

Коринеформные бактерии. Ряд представителей рода Corynebacterium (C. betae и др.), а также Brevibacterium синтезируют преимущественно разветвленные ЖК, среди которых преобладает (до 50% от суммы ЖК) антеизо-гептадекановая кислота (ai17). Избыточное содержание этого вещества, выявленное по балансу ai17, указывает на наличие в пробе коринеформных бактерий.

Peptostreptococcus anaerobius. Показано, что этот микроорганизм имеет в профиле ЖК редко встречающиеся четные изокислоты с числом атомов углерода от десяти до шестнадцати [11;30]. Максимальной в профиле является изотетрадекановая кислота i14, которую можно использовать в качестве маркера.

Bacillus. Присутствие бацилл можно детектировать по специфическим разветвленным кислотам с 13 атомами углерода: i13 и а13.

Acinetobacter. В качестве родового признака удобно использовать 2-оксидодекановую кислоту [38] при наличии 3-оксидодекановой.

Cl. perfringens. Имеет четкие маркеры, характерные для группы клостридий, включающей,  кроме Cl. perfringens, также Сl. histolyticum и Cl. oedematiens. Это 10-оксистеариновая и 10-оксиоктадеценовая кислоты, легко определяемые по специфическим ионам в масс-спектре [5]. Эти вещества не являются клеточными компонентами самих клостридий, а связаны с разложением клеток ткани макроорганизма бактериальными ферментами [9]. Сl. perfringens, так же как и Eubacterium входит в состав основной микрофлоры кишечника. Поэтому ранее мы обнаруживали их маркеры (10-оксикислоты) во всех биологических жидкостях человека, а также в сточных водах и объектах окружающей среды наряду с копростанолом.

Bacteroides fragilis. Анаэробные бактерии группы B. fragilis имеют хороший маркер - пару разветвленных оксикислот: изогептадекановую (основную) и антеизогептадекановую - меньшую по концентрации [16;25].

Streptococcus. Многие стрептококки “невидимы” на фоне компонентов биологической жидкости из-за совпадения собственных жирных кислот с кислотами субстрата. Однако группа оральных стрептококков (a-стрептококки) S. mutans, S. salivarius и др., имеющих в составе декановую кислоту С10 [36], а так же мононенасыщенные кислоты 16:1D7 и 18:1D11 (собственные измерения). Энтерококки группы S. faecalis, S. faecium также могут быть обнаружены при их лидерстве в сообществе по лактобацилловой (19cyc) кислоте [6], при этом сами лактобациллы определяемы по специфическому альдегиду.

Candida albicans.  Специфическим признаком этих микроскопических грибов в липидной фракции биологических жидкостей человека является гептадеценовая кислота [собственные данные].

Микроскопические грибы. Неспецифическим маркером клинически значимых микроскопических грибов (Aspergillus, Candida, Mucor и др.) является эргостерол [12] .

Flavobacterium (Sphyngobacterium). Эти бактерии имеют достаточно маркеров для детектирования в биологических жидкостях: изогептадеценовая кислота i17:1 -  наиболее удобная в качестве аналитического признака. Кроме того, они имеют разветвленные нечетные 2-оксикислоты в составе клеточных сфинголипидов (2hi15, 2hi17), которые так же могут служить маркерами в клинических пробах [38].

Streptomyces. В профилях ЖК биологических жидкостей пациентов присутствует значительное количество изогексадекановой кислоты i16, существенно превышающее возможную долю P. anaerobius и Bacillus, имеющих это вещество в составе клеточной мембраны. Редкими организмами (из известных нам), обладающих этим признаком являются, кроме бацилл, представители рода Streptomyces и некоторых других актиномицетов. Штаммы стрептомицетов, имеющие до 40%  i16 в профиле жирных кислот описаны в литературе [26] и обнаружены нами среди клинических изолятов. В литературе имеются данные об участии стрептомицетов в колонизации и воспалении различных органов человека.

Helicobacter pylori. Практически везде в профиле минорных компонентов жидкостей УГТ присутствует оксиоктадекановая кислота h18. Известны два вида микроорганизмов, для которых характерна эта оксикислота: Francisella tularensis и Helicobacter pylori [38]. Francisella является возбудителем туляремии и ее присутствие у обследуемых нами пациентов маловероятно. Поэтому наличие h18 следует отнести к Helicobacter pylori или к неизвестному пока источнику. H. pylori  традиционно связывают с хроническим гастритом, однако появляются сведения о его присутствии в тканях больных с  изязвлениями языка, атеросклеротических бляшках и абсцессе печени.

Mycobacterium. Неспецифическим тестом на микобактерии, выполняемом методом ГХ или ГХ-МС, является детектирование туберкулостеариновой кислоты в очаге поражения [23]. Дополнительные данные, полученные недавно по 3-оксикислотам липидов микобактерий позволяют его сделать специфичным для M.tuberculosis  и других представителей рода [10].

Neisseria.  Среди представителей рода имеются сапрофиты, обитающие на слизистой полости рта. Этот род характеризуется высоким содержанием 3-оксилауриновой кислоты, которое составляет 10-20% суммарного профиля ЖК. Несколько меньше содержание 3-оксимиристиновой кислоты [38]. Эти кислоты являются частью липида А  в ЛПС нейссерий, а также псевдомонад и ацинетобактера. Их перекрывание может быть учтено в простой формуле, поскольку альтернативные организмы имеют маркеры. Кроме того, они обычно отсутствуют в пробах (нет 2h12) и вся величина 3h12 приходится на долю нейссерий.

Fusobacterium. Единственным отличительным компонентом в клеточных ЖК эти бактерий является 3-оксимиристиновая кислота (3h14) [17], которая к тому же встречается и у других грамотрицательных организмов клинического значения, таких как E.coli, Klebsiella, Serratia и другие. Поэтому Fusobacterium, Haemophylus могут быть определены лишь по остатку в уравнении баланса для 3h14.

Staphylococcus. Известно, что стафилококки содержат нечетные изо- и антеизо- разветвленные кислоты с числом атомов углерода 15,17 и 19 [99,100]. Три клинически важных вида этого рода бактерий (S. aureus, S. haemolyticus, S. epidermidis) могут быть приближенно разделены при использовании разницы в соотношении этих кислот в профиле ЖК.

 Corinebacterium (дифтероиды)-Listeria. После учета всех микроорганизмов, имеющих в составе ЖК антеизо-гептадекановую кислоту, часто наблюдается остаток. Представляется наиболее вероятным отнести его за счет неучтенных коринебактерий, известных особенно высоким содержанием кислот  а15 и а17, и по этому признаку выделенных в отдельную группу СDC A-3,A-4, A-5, B-1a, B-3a, B-1b, B3b,  Corinebacterium aquaticum (а также листерий и бревибактерий).

Вирусы.  По сопоставлению наших данных с данными анализа иммунным и генетическим методами ряда пациентов с различными патологиями мы обнаружили корреляцию в появлении метаболита холестерина холестендиола при инфекции вирусом герпеса и холестадиенона при инфицировании цитомегаловирусом.

По методу, описанному выше, проведена оценка численности микроорганизмов, населяющих слизистую оболочку кишечника в норме (таблица 2) в биоптатах тощей, подвздошной и ободочной кишок в соответствии с концентрацией их маркеров. При этом из вариантов микроорганизмов для одного и того же маркера выбраны наиболее вероятные по условиям местообитания и баланса жирных кислот в микробном сообществе [33].

Таблица 2.Численность пристеночной микрофлоры в разных отделах кишечника и в  фекалиях в норме

У больных СРК обнаружены отклонения от нормы до 30 кратного увеличения или уменьшения многих компонентов. Частота таких изменений для тонкой и толстой кишок, а также крови показана в таблице 3. Учитывались только те изменения, которые более чем вдвое отличались от нормы по концентрациям соответствующих маркеров.

Анализ данных таблицы 3 показывает, что у данной группы больных в основном происходит уменьшение концентраций маркеров (13 из 26) тонкой кишки от 2 до 30 раз. Те же самые маркеры обнаруживают уменьшение концентрации в крови (выделены жирным шрифтом цифры в таблице 3).  Только 6 маркеров, соответствующих Enterococcus, Candida albicans, a-Streptococcus, Bacillus, Eubacterium и Acinetobacter в большинстве случаев количественно растут. Для 8 микроорганизмов изменения концентраций их маркеров происходят в одну сторону одновременно по кишечнику и в крови. Маркеры энтерококка и кандиды растут, а клебсиелл, Cl. perfringens, нокардий, Bacteroides ureolyticum, H. pylori и Actinomadura уменьшаются. Четыре маркера меняются в тонкой и толстой кишке в разные стороны: численность Peptostreptococcus anaerobius и Staphylococcus aureus уменьшаются в тонкой кишке, но растут в толстой, a-Streptococcus, напротив, в большинстве случаев растет количественно в тонкой, и уменьшается  в толстой кишке.

Таблица 3. Число случаев увеличения или уменьшения концентрации маркеров микроорганизмов  по отделам кишечника и в крови у больных с синдромом раздраженного кишечника.

 (* - увеличение , ** - уменьшение более чем в два раза по сравнению с нормой)

Анализ этих результатов в сопоставлении с клиническими данными будет предметом дальнейших исследований.  Остановимся пока  на осмыслении полученных аналитических данных по концентрации микробных маркеров в стенке кишечника и в крови. Важным результатом является качественное соответствие состава минорных ЖК и стеролов в этих органах. Еще более важна количественная адекватность изменений их концентраций в тонкой кишке и в крови. Это означает возможность неинвазивной оценки изменений микрофлоры кишечника по данным анализа крови методом ГХ-МС микробных маркеров. То, что корелляция имеет место между кровью и пристеночной микрофлорой тонкой кишки соответствует известным представлениям о биохимии всасывания липидов, витаминов и прочих компонентов пищи, которое происходит именно в тонкой кишке. В его эпителии происходит разборка и повторная сборка глицеридов пищи и поступление их в кровь. Естественно, то же самое происходит, видимо, с липидами отмирающих клеток микроорганизмов, колонизирующих тонкую кишку, или в результате их фагоцитоза. При этом пищевая компонента создает некий нормальный фон, относительно которого мы можем наблюдать изменение микробиоза или появление инфекции.

Нам удалось измерить концентрацию микробных компонентов непосредственно в месте обитания, где присутствуют сами клетки микробов кишечной стенки, а не их свидетели в виде мономеров липидов, как  в крови или моче. Поэтому мы вправе делать прямые доступные нам сопоставления между концентрацией маркеров и числом микробных клеток в условиях отсутствия пищевой липидной компоненты, поскольку биоптаты получали натощак. Такая логика убеждает нас в том, что мы измерили  ведущую микрофлору кишечной стенки. Ведущую в количественном отношении, так как оказалось, что при наличии биоптата весом 4мг мы можем детектировать микроорганизмы начиная с концентрации 10⁴ - 10⁵ кл/г, значит значительная часть микрофлоры осталась вне поля наших возможностей. Однако аналитические ресурсы еще не исчерпаны. При следующих измерениях вполне реально повысить чувствительность на порядок. Как оказалось, общая численность микроорганизмов кишечной стенки имеет величину порядка 1х10¹⁰ кл/г.

Плотность заселения стенки кишечника в дистальном направлении  меняется мало: в подвздошной кишке она в два раза меньше, а в толстой в полтора раза больше, чем в тощей. Пристеночная микрофлора оказывается существенно более концентрированной, чем просветная, которая в тонкой кишке на шесть порядков ниже по численности (10⁵ кл/мл). Для подвздошной кишки определенных данных нет, в ободочной кишке измеренная нами концентрация микробов по порядку величины соответствует таковой в ее содержимом, а их видовой состав  - известным представлениям о компонентах кишечной микрофлоры [24].

Групповой состав пристеночной микрофлоры представлен в таблице 4. Основную долю (около половины биомассы) составляют актиномицеты. Далее по численности следуют аэробные кокки (стафилококки, стрептококки, энтерококки и коринеформные бактерии) - около 1/3 ( от 20 до 30%) составляют бифидобактерии и лактобациллы. Меньшинство составляют анаэробы (пептострептококки, бактероиды, клостридии, пропионобактерии) - их численность около 10% в тонкой и до 20% в толстой кишке. На долю энтеробактерий приходится 1% от суммарной микрофлоры слизистой оболочки, причем основную долю составляют клебсиеллы (90%), которых на порядок больше, чем всех прочих представителей семейства Enterobacteriaceae.

Таблица 4.  Состав микроорганизмов стенки кишечника и в фекалиях по группам

Изменение состава микрофлоры у больных СРК по сравнению со здоровыми людьми можно охарактеризовать как рост численности в слизистой оболочке тонкой кишки бактерий рода Eubacterium (более чем в 30 раз), альфа-стрептококков (до 25 раз), энтерококков (до 10 раз), кандид (до15 раз) и появление в измеримых количествах маркера грамотрицательных бактерий рода Acinetobacter. В нескольких случаях отмечены существенно высокие концентрации вирусов герпеса. Но более массовым явлением выглядит уменьшение численности по крайней мере тринадцати других таксонов микроорганизмов. А именно, большинства анаэробов (пептострептококки, пропионобактерии, клостридии, фузобактерии, Bacteroides ureolyticum), актиномицетов, клебсиелл, других членов сем. Enterobacteriaceae и H. pylori. Фиксировалось уменьшение их численности от 2 до 30 раз у разных пациентов. Все перечисленные микроорганизмы являются естественными обитателями кишечника, поэтому, в пределах чувствительности метода (в данном случае 10⁵ кл/г) мы имеем дело с тем, что обычно называют дисбиозом.

Выводы

1. Состав минорных жирных кислот и стеролов в крови полностью соответствует составу в слизистой оболочке кишечника. Установлена количественная адекватность изменений концентраций микробных маркеров в тонкой кишке и крови, что открывает возможность оценки изменений микрофлоры кишечника по данным анализа крови.
2. Общая численность микроорганизмов кишечной стенки имеет величину порядка (0,5 - 1,3) ´ 10¹⁰ кл/г. Концентрация пристеночной микрофлоры тощей кишки составляет 10¹⁰ кл/мл, т.е. на 5 порядков выше, чем в ее полости. В ободочной кишке концентрация микробов по порядку величины соответствует таковой в ее содержимом.
3. Около 50% биомассы пристеночной микрофлоры составляют актиномицеты, около 25% - аэробные кокки (стафилококки, стрептококки, энтерококки и коринеформные бактерии), от 20% до 30% составляют бифидобактерии и лактобациллы. Количество анаэробов (пептострептококки, бактероиды, клостридии, пропионобактерии) составляет около 10% в тонкой и до 20% в толстой кишке. На долю энтеробактерий приходится 1% от суммарной микрофлоры слизистой оболочки.
4. У больных с синдромом раздраженного кишечника с преобладанием поносов численность одних микробов  в слизистой оболочке тонкой кишки увеличена, других – уменьшена. Отмечается увеличение Eubacterium (в 30 раз), a-стрептококков (в 25 раз), энтерококков (в 10 раз), кандид (в 15 раз), появление бактерий рода Acinetobacter и вирусов герпеса. Уменьшено от 2 до 30 раз  количество большинства анаэробов, актиномицетов, клебсиелл и  других микроорганизмов, являющихся естественными обитателями кишечника.
5. Метод газовой хроматографии - масс-спектрометрии микробных маркеров открывает новый этап в изучении проблемы микробиоценоза и диагностики дисбактериоза кишечника.

Литература

1. Белобородова Н.В., Осипов Г.А. Гомеостаз малых молекул микробного происхождения и его роль во взаимоотношениях микроорганизмов с хозяином. //Вестник РАМН. -1999. T.16, -№7, с. 25-31.
2. Определитель бактерий Берджи. Под ред. Дж.Хоулта и др. М.Мир, 1997, т.1,2, 638с.
3. Осипов Г.А. Демина А.М. Хромато-масс-спектрометрическое обнаружение микроорганизмов в анаэробных инфекционных процессах.// Вестник РАМН. -1996. Т.13, №2, с.52-59.
4. Осипов Г.А. Шабанова Е.А. Бабайцева В.А. и др. Способ диагностики клостридиальной анаэробной газовой инфекции. Патент РФ №2021608 кл.G01N 33/50.- Зарегистрировано в гос. реестре 15.10.94.- Бюл.№19.
5. Седов В.И., Пинчук Л.М. Состав высших жирных кислот энтерококков.// Журн.Микроб.Эпидем.Иммун., 1982, 9 ,49-59.
6. Физиология человека, гл.18, Функция крови, Т.2, С.414-430. Под ред. Р.Шмидта и Г.Тевса. М.Мир,1996.
7. Allen S.D., Siders J.A., Riddell M.J., et al. Cellular fatty acid analysis in the differentiation of Clostridium in the clinical microbiology laboratory. //Clin.Infect.Dis. 1995 Jun;20 Suppl 2:S198-201. 
8. Allugupalli S., Portaels F., Larsson L. Systematic study of the 3-hydroxy fatty acid composition of mycobacteria. // J.Bacteriol. May 1994, 176(10), 2962-2969.
9. Armfield A.Y. Differentiation of Peptococcus and Peptostreptococcus by gas-liquid chromatography of cellular fatty acids and metabolic products.// J.Clin.Microbiol. 1979 Oct;10(4):464-76.
10. Axelsson B.-O., Saraf A., Larsson L. Determination of ergosterol in organic dust by gas chromatography - mass spectrometry. // J. Chromatogr.B, 666 (1995) 77-84.
11. Beloborodova N.V., Osipov G.A. 2000. Small molecules originating from microbes(SMOM) and their role in microbes-host relationship.// Microb. Ecol.Heal.Dis., SCUP, 12: 12-21. 
12. Brandtzaeg, P., Bryn, K., Kierulf, P., et al. 1992. Meningococcal endotoxin in lethal septic shock plasma studied by gas chromatography, mass-spectrometry, ultracentrifugation and electron microscopy.// J.Clin.Investig. 89, 816-823.
13. Brondz, J., Olsen, J. Microbial chemotaxonomy. Chromatography, electrophoresis and relevant profiling techniques. // J. Chrom., Biomed.1986, Appl., 379, 367-411.
14. Brondz I., Olsen I. (1991)  Multivariate analyses of cellular fatty acids in Bacteroides, Prevotella, Porhyromonas, Wolinella and Campylobacter spp. // J.Clin.Microb., V 29 (1) :183-89.
15. Chemical Methods in Bacterial Systematics (1985) (Goodfellow, M. and Minnikin, D.E., Eds.), Acad. Press, London - Toronto.
16. Chemical methods in Procariotic Systematics (1994) ( Goodfellow, M. and O’Donnell, A.G., Eds.), John Willey and Sons, .Chiduster, UK.
17. Dennemont J., Roupas A., Heitz M. Differentiation of Campylobacter jejuni, C.coli, C.lary and C.fetus fatty acid profiles obtained by gas chromatography - mass spectrometry and by their hippurate hydrolysis. // Mitt. Geb.Lebensmittelunters.Hyg.- 1992.-Vol.83.-N2.-P.142-150.
18. Koichi T.  On the production of hydroxy fatty acids and fatty acids oligomers in the course of adipocere formation.// Nippon Hoigaku Zasshi.-1984.-Vol.38.-No.3.-P.257-272.
19. Lehtonen L., Eerola E., Oksman P. Muramic acid in peripherial blood leukocytes of healthy human subjects. // J.Infect.Dis. 171, 1060-1064, 1995.
20. Maitza S.K., Schotz M.C., Yoshikawa T.T., Guze L.B.// Defermination of lipid A and endotoxin in serum by mass-spectroscopy.// Proc.Natl.Acad.Sci.USA.-1978.-V.75.-P.3993.
21. Manual of Clinical Microbiology. 5-th ed. Editor in Chief - Albert Balows. Washington, 1991, pp. 317-318.
22. Manual of Clinical Microbiology. 5-th ed. Editor in Chief - Albert Balows. Washington, 1991, pp. 8. 
23. Mayberry W.R., Lambe D.W.,Jr.; Ferguson H.P.// Jdentification of Bacteroides species by cellular fatty acid profiles.// Int.J.Syst.Bacteriol.-1982.-Vol.32(1).-p.21
24. McNabb A., Shuttleworth R., Behme R. et al. Fatty acid characterization of rapidly growing pathogenic aerobic actinomycetes as a means of identification. // J.Clin.Microbiol. 1997, v.35, N.6, p.1361-1368.
25. Miyagawa E., Cellular fatty acid and fatty aldehyde composition of rumen bacteria. // J.Gen.Appl.Microbiol. 28, 389-408 (1982).
26. Morgan, S.L., Fox, A., Gilbart, J.  Profiling, structural characterization, and trace detection of chemical markers for microorganisms by gas chromatography - mass spectrometry. // J.Microbiol.Methods. 1989, 9, 57-69.
27. Mott G.E., Brinkley A.W. Plasmonylethanolamin: growth factor for cholesterol-reducing Eubacterium. // J.Bacteriol., 1979,139(3),755-760
28. Moss C.W., Lambert M.A. Lombard G.L. Cellular fatty acids of Peptococcus variabilis and Peptostreptococcus anaerobius.//. J. Clin.Microbiol. 1977, 5(6), 665-7.
29. Nichols P.D., Leeming R., Rayner M.S., et al. (1996). Use of capillary gas chromatography for measuring fecal-derived sterols. // J.Chrom.,A 733, 497-509.
30. Osipov G.A., Boiko N.B., Verkhovtseva N.V. et al. Preliminary differentiation of bacteria in clinical and environmental samples by fatty acid features and profiles. // J.Microbiol.Methods. 2001 (in press). Special issue. Proceedings of the 4-th Int.Symp. on the Interface between Analytical Chemystry and Microbiology, June 4-7, 2000, Tregastel - Bretagne, France. 
31. Osipov G.A., Turova E.S. (1997) Studying species composition of microbial communities with the use of gas chromatography-mass spectrometry. Microbial community of kaolin. // FEMS Microbiol.Rev. 20 (1997) 437-446.
32. Stead, D.E., Sellwood, J.E., Wilson, J., et al. Evaluation of a commercial microbial identification system based on fatty acid profiles for rapid, accurate identification of plant pathogenic bacteria.// J.Appl.Bacteriol. 1992, 72, 315-321.
33. Sud I.J., Feingold D.S. Detection of 3-hydroxy fatty acids of picogram levels in biologic specimens. A chemical method for the detection of Neisseria 94. gonorrhoeae? // The Journal of Investigative Dermatology. 1979,v.73,p521-526.
34. Tsuchiya H., Masaru S., Kato M. et al., High-Perfomance  Liquid Chromatographic analysis of bacterial fatty acid composition for chemotaxonomic characterization of oral streptococci.// J. Clin.Microbiol.,  1986, 24(1), 81-85.
35. Veerkamp J.H. Fatty acid composition of Bifidobacterium and Lactobacillus.//  J.Bacteriol., 1971, 108(2), 861-867.
36. Weyant R.S., Moss C.W., Weaver R.E., et al. Identification of Unusual Pathogenic Gram-Negativ Aerobic and Facultatively Anaerobic bacteria. Second edition. Williams and Wilkins, 1996.
37. White, D.C. (1988) Validation of quantitative analysis for microbial biomass, community structure, and metabolic activity.// Adv. Limnol.1988, 31, 1-18.

     

    Banners Exchange System 'Flamingo'