Русский Медицинский Сервер - Разное

Резюме
Из 5-ти ВИЧ-положительных сывороток с высоким титром белка р24, методом клонирования прединтеграционных комплексов (ПИК) получены пять библиотек молекулярных клонов ВИЧ1. Определены условия и выделен штамм E. coli, при использовании которых плазмиды, содержащие полноразмерные провирусные геномы ВИЧ1, эффективно трансформируют клетки и стабильно в них наследуются. На модели исключения мультикопийной плазмиды рBR322 выявили способность клонированных провирусных геномов индуцировать образование коинтегратов между гибридными плазмидами и хромосомой E. coli.

ВВЕДЕНИЕ
Провирус ВИЧ1 впервые клонирован в 1986 году [8]. В первой публикации обсуждается специфическая структура единичной копии провируса, который получен из библиотеки геномной ДНК ВИЧ-инфициованного и находится в составе плазмиды pNL4-3. По своей структуре он был ретротранспозоном [22]. В дальнейшем была показана принципиальная возможность получения молекулярных клонов ретровирусов in vitro в реакции образования коинтегратов между ДНК плазмид и прединтеграционными комплексами (ПИК-ами), которая проходит не зависимо от АТФ и исключительно с образованием гибридных молекул [11]. Такая методика клонирования ПИК-ов ВИЧ1 в мультикапийной плазмиде приводит к выделению молекулярных клонов ВИЧ1 [8]. Гибридные плазмиды, содержащие ПИК-сы, наследуются в клетках E.coli К12 исключительно нестабильно [23]. В настоящем исследовании найдены условия стабильного наследования гибридных плазмид, содержащих ПИК-сы, клонированных в клетках E.coli К12. Установили также, что при стабильном наследовании плазмид, содержащих полноразмерные геномы ВИЧ1, с небольшой частотой происходят ВИЧ-зависимые инсерции плазмиды, содержащей провирусный геном ВИЧ1, в хромосому клеток бактерии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
        Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в работе, описаны в Таблице 1.
Среды и условия культивирования. Для выращивания бактериальных культур E.coli использовали жидкую или агаризованную среду L [3]. Селективные среды с антибиотиками содержали их в концентрации 50 мкг/мл.
Источником мононуклеров периферической крови человека (МПКЧ) служила кровь здоровых доноров. МПКЧ отделяли от крови центрифугированием на ступенчатом градиенте Ficol 400 [9]. Для культивирования МПКЧ использовали среду RPMI1640 c 10% фетальной бычьей сыворотки (Serva) и необходимыми интерлейкинами, а также ФГА [10,17].
Получение и клонирование ПИК. МПКЧ, активированные ФГА, в титре 2 х 10⁷ вносили в сыворотки с высоким титром р24 [7] и инкубировали клетки 6 – 8 часов. Клетки переносили в буфер «K» (20 mM HEPES [pH=7.3], 150 mM KCl, 5 mM MgCl₂ ,1 mM дитиотреитола, 50 ед/мл апротинина и 0,05% тритона Х100). Из осветлённого лизата ПИК осаждали центрифугированием (8000 об/мин., 15 минут). Количество ДНК в пробах определяли спектрофотометрически, сравнивая пробы с контролем (МПКЧ, лизированные 0,05% тритоном Х-100). Экспериментальные пробы содержали 40 – 80 нг ДНК. Смесь ДНК из пробы и плазмиды pBR322 (суммарно 50 нг) в количестве 100 мкл переносили в буфер «А» (10 мм MgCl₂, 20 мм HEPES [pH=7.2], 10% PEG8000, 5 мМ апротинина и 1 мм DTT. Смесь ДНК переносили в термостат при 25^оС, выдерживали 30 минут и смесью проводили трансформацию компетентных клеток E. coli.
Методы генетического обмена. Трансдукцию бактериофагом P1vir проводили по модифицированной методике, описанной ранее [4]. Трансформацию компетентных клеток E.coli плазмидной ДНК проводили согласно стандартной схеме [18].
«Выщипление» плазмид из популяции клеток E,coli проводили по схеме [2]. Внехромосомную ДНК определяли по Кадо [12].
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с использованием Taq- (Pfu-) полимеразы с указанными ниже праймерами и условиями (в скобках показаны условия для Pfu-полимеразы). Синтез, очистку и анализ структуры праймеров проводили специалисты АО “Синтол”.
Протокол ПЦР: прогрев 94^оС – 3 мин., первый раунд – 5 циклов: прогрев 94^оС – 30 сек., отжиг 50^оС (50^оС) – 30 сек., синтез 72^оС – 30 сек. (3 мин.), второй раунд: прогрев 94^оС – 30 сек., отжиг 56^оС (50^оС) – 30 сек., синтез 72^оС – 30 сек. (3 мин.), хранение 10^оС. Последовательности используемых праймеров приведены в таблице 2.
Размер ампликонов определяли путём сравнения их подвижности в агарозном геле (1% – 2%) с подвижностью фрагментов ДНК известного размера (маркеры подвижности “Promega”).
ДНК-ДНК гибридизацию проводили в соответствии с методикой, описанной нами ранее [1].
Определение последовательности амплифицированных фрагментов, проводили методом Сангера [В39] с использованием набора реагентов «Dye Deoxy Terminator ABI sequencing Kit with Taq-polymerase FS» («Perkin-Elmer», USA). Продукты реакций удлинения анализировали в автоматическом режиме на секвенаторе 373А Automatic Sequencer (Applied Biosysthems USA).
Определение титра белка р24 методом ИФА [7] проводили с помощью коммерческих наборов.
Программное обеспечение: расчёт праймеров (PrimPCR [v. 1.0]; Oligo [v. 5.0]; сайт Blast), банк последовательностей (сайт Entrez), анализ последовательностей (GeneRunner [v. 3], Dnastar [v. 5]), гель-документирующая система (DNAimeger [Pro-mega, v. 2.0]), анализ гелей (DNAanalysis [Promega, v. 2.5]), математическая и статистическая обработка результатов (StudyWKS [v. 4.5]).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Распространение ретровируса ВИЧ1 в России [13] делает всё более очевидной необходимость внедрения методов молекулярной биологии в диагностическую поликлиническую практику. В первую очередь, желательно наладить выделение молекулярных клонов ВИЧ таким набором методов, которые бы имели прототипы в поликлинической диагностической практике.
Теоретически существует три способа получения молекулярных клонов ВИЧ1. Во-первых, селекция специфических последовательностей из геномной библиотеки ДНК, выделенной из CD4⁺-клеток крови ВИЧ-инфицированных [8]. Однако, соотношение между здоровыми и инфицированными CD4⁺-клетками в начале инфекционного процесса такова, что вероятность достичь успеха трудоёмким методом снижается до минимума.
Во-вторых, методом коинтеграции между плазмидой - вектором и ПИК-ом ретровируса in vitro [11]. Для получения реакции коинтеграции, ДНК ПИК-са ВИЧ1 выделяют из цитоплазмы активированных и заражённых ретровирусом МПКЧ [17], которые, в основном, являются CD4⁺-клетками [14]. Успех, при этом, зависит от эффективности каждого из трёх процессов: трансформации клеток бактерий, селекции клонов с гибридными плазмидами и стабильного наследования этих плазмид в потомстве трансформантов.
В-третьих, так, как это было использовано для секвенирования «российских» геномов ВИЧ1 [15], с помощью ПЦР, сопряжённой с обратной транскрипцией. С целью получения молекулярных клонов, необходимо использовать метод «длиной» ПЦР или его вариант, сопряжённый с обратной транскрипцией.
Однако, любая модификация «длиной» ПЦР для амплификации геномов ВИЧ1, которые проводят с целью получения молекулярных клонов вируса, будет абсолютно зависима от эффективностей трёх указанных процессов: трансформации клеток бактерий, селекции клонов с гибридными плазмидами и стабильного наследования этих плазмид в потомстве трансформантов. Сравнивая три метода клонирования ВИЧ, следует учесть, что манипуляции с МПКЧ и ПЦР уже нашли применение в поликлинической диагностической практике, а те фрагменты метода, которые ещё не используются, могут быть стандартизованы с теми же целями.
Именно поэтому, целью настоящей работы была разработка лабораторного протокола эффективного клонирования ПИК-ов ВИЧ1 в плазмиде pBR322, получение молекулярных клонов и их предварительное изучение.

1. Условия наследования плазмиды pNL4-3.
Для подбора условий клонирования провели трансформацию клеток пяти различных штаммов E.coli К12 очищенным препаратом ДНК плазмиды pNL4-3 (Асс. № AF324493 GenBank). Результаты полученных экспериментов приведены в таблице 3.
Клетки, получившие плазмиду pNL4-3, давали Amp^R потомство только на 1,5% LA с ампициллином, в то время, как после трансформации клеток плазмидой pBR322, Amp^R потомство можно получить на среде McConkey. Это значит, что у Amp^R трансформантов, получивших плазмиду pNL4-3 проницаемость клеточной стенки повышена, в то время как присутствие плазмиды pBR322 к этому эффекту не приводит. Возникающая при этом чувствительность к кислороду [2] эффективно снимается ингибитором разветвления свободнорадикальной цепной реакции – ундекилвиологеном [6]. Действительно, при введении ундекилвиологена (100 пкМ) в состав селективной среды, наблюдали значительный прирост количества Amp^R трансформантов, получивших плазмиду pNL4-3 (см. табл. 3).
С частотой не более 0,001% в потомстве Amp^RPol⁺ трансформанта штамма c6007 обнаруживали сегреганты, способные расти при 37^оС. При анализе их фенотипов обнаружили у них устойчивость к действию антибиотика рифампицин – ингибитора синтеза РНК [18], взаимодействующий с b' – субъединицей РНК-полимеразы E.coli [20]. Сегрегант c6008 эффективно наследовал плазмиду pNL4-3 (см. рис. 3). По данным ПЦР (см. рис. 3), в плазмидной ДНК, выделенной из клеток штамма c6008, есть гены pol и vpr, а также LTR последовательности.
Таким образом, стабильное наследование плазмиды pNL4-3, содержащей полноразмерный геном ВИЧ1, происходит в клетках штамма c6008, которые пассируют в условиях отсутствия общих компонентов ФТС на средах с ундекилвиологеном.
2. Клонирование ПИК и наследование гибридных плазмид.
Условия, способствующие стабильному наследованию плазмиды pNL4-3, использовали для клонирования гибридных плазмид, содержащих ПИК. Образцы, которые дают специфические продукты ПЦР на ДНК гена pol (праймеры №1 и №2) и на ген vpr (№5 и №6, получали из 5-ти ВИЧ-положительных сывороток с высоким титром белка р24 по схемам приведённым в разделе «Материалы и методы». Образцы, содержащие ДНК ПИК-ов смешивали с ДНК плазмиды pBR322 и через 30 минут инкубации, реакционной смесью проводили трансформацию компетентных клеток. Результаты трансформации клеток штамма c6008 представлены в таблице 3. Присутствие последовательностей провируса ВИЧ1 в ДНК трансформантов анализировали с помощью блот-гибридизации и последующего определения размеров плазмид. В каждом из 16-ти экспериментов процент клонов, содержащих гибридные плазмиды расчётного размера, был не менее 15%. В ДНК, выделенной из материала 22 произвольно отобранных Amp^R клонов, после каждого из десяти пассажей на селективных средах, методом ПЦР с парами праймеров №1,2; №3,4; №5,6 можно было обнаружить продукты амплификации расчётного размера (соответственно, 287, 609 или 355, 293 п.о.). Один из этих Amp^R клонов, содержал гибридную плазмиду получившую название pPIC91. Плазмида pPIC91, после 8 пассажей, была выделена из клеток штамма c6009, а продукты амплификации её ДНК с парами праймеров №1,2; №3,4; №5,6, №7,8 и №7,9, отсеквенировали.
Таким образом, наследование плазмид, содержащих ПИК ВИЧ1, клетками штамма c6008, растущими в указанных выше условиях, происходит, видимо, без нарушения структуры ПИК. Объяснение этому нами не понято, но будем работать
3. Плазмида pPIC91 способна коинтегрировать с хромосомой.
Одним из авторов настоящей работы была установлена связь между обра-зованием коинтегратов плазмиды, содержащей полноразмерную и укороченную копии IS481, с хромосомой и функционированием общих компонентов фосфое-нолпируват-зависимой фосфотрансферазной (ФТС) системы транспорта углеводов [5]. Поэтому, использовали указанную схему для определения функциональной способности интегразы ВИЧ1, который находится в составе плазмиды pPIC91. Это было тем более интересно, в связи с ранее установленной функциональной активностью клонированной интегразы ВИЧ1 в клетках E.coli.
При элиминации плазмиды pPIC91 из популяции клеток штамма c6009, выращенного в присутствии 1% фруктозы, наблюдали сохранение маркера Amp^R с частотой характерной для “интмиды” pKK3 (10^-7/клетку, см. табл. 3). В потомстве клонов, сохранивших маркер Amp^R, нет внехромосомной ДНК. Некоторые Amp^R клоны, не имеющие внехромосомной ДНК, одновременно являются инсерцион-ными ауксотрофными мутантами ,например, по серину (согласно номенклатуре инсерционных мутаций AceK::pPIC91). Частота реверсии SerЮSer⁺ <10^-7, а большинство Ser⁺ клонов имеют фенотип Amp^S. Частота реверсии SerAmp^RЮ Ser⁺Amp^R <10^-8, причём Ser⁺Amp^R клоны зачастую приобретают другую ауксотрофность, так называемую «вторичную». Установили, что в потомстве «вторичных» ауксотрофов, как и в потомстве исходного клона, внехромосомной ДНК нет. Полученные результаты заставляют предполагать, что, в случае возникновения ауксотрофных мутантов, вероятно, происходит интеграция всей последовательности плазмиды pPIC91, которая способна перемещаться в новые сайты, индуцируя «вторичные» ауксотрофы. На рисунке 2 приведена структура кинтеграта pPIC91 с хромосомой, построенная на основании результатов секвенирования.
Полученные результаты, однозначно указывают на функциональную активность интегразы ВИЧ1, ген которой находится в молекулярном клоне плазмиды pPIC91.
4. Определение структуры сайта интеграции AceK::pPIC91.
Для определения последовательности нуклеотидов в сайте AceK::pPIC91 получали продукты амплификации в ПЦР с парами праймеров №7,10 и №8,10. Праймеры №7 и №8 использовали в реакциях удлинения с Taq-полимеразой. Результаты секвенирования продуктов амплификации сравнивали с последовательностью нуклеотидов полного генома Escherichia coli (acc. №U00096). Компьютерное сравнение проводили с помощью одноимённой программы компании «Dnastar Inc.» и программы «GeneRunner». Результаты суммированы на рисунке 2. При 92% гомологии сравниваемых последовательностей, интеграция плазмиды pPIC91 произошла между нуклеотидами 4217288 и 4217289 генома Escherichia coli. В результате реакции, которую, вероятно, катализировала интеграза ВИЧ1, дуплицирована пятичленная (4217284 - 4217288) ID-последовательность хромосомы бактерии (на рис. 2 подчёркнута), граничащая с прямыми повторами, возможно, полноразмерных копий LTR. Вероятно, структура коинтегратов плазмид pPIC91 и «интмиды» pKK3 [2], по своему характеру, совпадает.
Таким образом, в процессе разработки лабораторного протокола эффективного клонирования ПИК-ов ВИЧ1 в плазмиде pBR322 установлены условия, при которых уровень трансформации компетентных клеток бактерий достигает значений 10⁸ клонов на мкг ДНК. Ими являются:

1. штамм E.coli высококомпетентный для трансформации гибридными плазмидами;
   
2. среда, на которой проводится селекция трансформированных гибридными плазмидами клонов;
   
3. условия, при которых наследование гибридных плазмид происходит во внехромосомном состоянии.
   

С.

Русский Медицинский Сервер - Разное