Русский Медицинский Сервер - Разное
Тимен Л.Я., Шерцингер А.Г., Чичук Т.В., Варданян Э.С., Трубицына И.Е., Чикунова Б.З., Жигалова С.Б., Мусин Р.А., Ильина С.Е., Ольховский П.А., Стоногин С.В.,
| Клебанов Г.И |
Городская клиническая больница №20, Российский научный центр хирургии РАМН, кафедры биофизики и медицинской и биологической физики РГМУ,
ЦНИИ гастроэнтерологии, Москва.
Принятые сокращения:
АТР-аденозинтрифосфат.
В настоящее время свободнорадикальным реакциям, определяющим сущность «свободнорадикальных патологий», принадлежит одна из ведущих ролей в патогенезе различных заболеваний, в том числе и язвенной болезни [1,2,3,4]. Генерация активных форм кислорода, связанная с продолжительной тканевой гипоксией, препятствует заживлению язв, формированию полноценного рубца и создает прецедент для хронизации воспалительно-деструктивных изменений тканей [5]. На основании изучения патоморфологии тяжелой кровопотери и геморрагического шока при язвенных гастродуоденальных кровотечениях Л.Я. Тименым и соавт. [6] разработана концепция метаболической реабилитации, в соответствии с которой у шоковых пациентов в связи с энергетической недостаточностью с целью восстановления местного гомеостаза выполняется эндоскопический превентивный метаболический гемостаз с использованием 5% растворов глюкозы и аскорбата. Высокий противорецидивный и репаративный эффект этих препаратов, прошедших успешную экспериментальную проверку, был подтвержден и при лечении пищеводных кровотечений, а также осложнений, связанных с лигированием либо склерозированием варикозно-расширенных вен у больных с портальной гипертензией [7]. Но какова при этом динамика свободнорадикальных реакций? Существует ли необходимость коррекции свободнорадикального статуса? Эти вопросы и определили цель настоящего исследования – выяснить результаты воздействия аскорбата и глюкозы на механиз-мы свободнорадикального окисления.
Изучен свободнорадикальный статус крыс в процессе заживления экспериментальных ран при местном инъекционном лечении 5% растворами глюкозы и аскорбата. Исследования выполнены в трех группах беспородных крыс средним весом 300-350г: контрольной (8 крыс) и двух опытных (по 6 крыс), где применили инъекционные методики. Модельные раны (метод Л.И.Слуцкого), размером ≈ 3,0 см2, создавали в области холки животных под эфирным наркозом. На рану «одевалось» тефлоновое кольцо диаметром 2,0 см. Кольцо закрывалось полиэтиленовой пленкой, обработанной этиловым спиртом и фиксированной проволокой к основанию кольца (рис.1)
Рис.1
Экспериментальная модель раны.
В опытных группах крыс под раневую поверхность двукратно, с интервалом 48 часов, внутримышечно вводилось по 10мл 5% раствора глюкозы или аскорбата. Раневой экссудат собирали через 2, 3 и 4 суток после операции. Затем снимали кольца и наблюдали динамику заживления ран. Для оценки свободнорадикального статуса изучены изменения антиоксидантной способности раневого экссудата (активности супероксиддисмутазы, интенсивности и латентного периода кумарин-зависимой хемилюминесценция раневого экссудата в присутствии железа), а также функциональной активности лейкоцитов экссудата. Измерение активности супероксиддисмутазы выполнено в модификации Г.И. Клебанова и соавт., оценка кумарин-зависимой хемилюминесценции произведена в соответствии с модифицированной методикой Ю. А. Владимирова и соавт. Лейкоциты выделяли по методу А.Boyum, а их функциональная активность определена методом люминол-зависимой хемилюминесценции. С целью получения более объективной оценки результатов исследования регистрация всех показателей свободнорадикального статуса крыс производилась одновременно у каждого животного.
Заживление ран и язвенных дефектов в настоящее время можно рассматривать как сложный скоординированный стадийный процесс, протекающий в соответствии с особенностями адаптивной репарации. Несмотря на существенные различия в этиологии и патогенезе, течение ран и язвенной болезни объединяет общий стереотип, обусловленный одними молекулярно-клеточными механизмами деструктивных изменений и неспецифической реакцией клеток на повреждение [8]. Кроме того, продолжительность фазы репарации ран и гастродуоденальных язв в значительной степени зависит от активности свободнорадикальных реакций в зоне пораженного субстрата [1,5,9]. Сходство биологических процессов, отражающих закономерности заживления ран и язвенных дефектов, позволило нам избрать экспериментальную модель ран для изучения биофизических механизмов влияния глюкозы и аскорбата на активность свободнорадикального окисления.
Результаты выполненных исследований продемонстрировали анти- и прооксидантный эффект ингредиентов эндоскопического превентивного метаболического гемостаза, более выраженный у аскорбата. Оценка антиоксидантной защиты произведена на основании изменений активности супероксиддисмутазы, а также интенсивности и латентного периода кумарин-зависимой хемилюминесценции раневого экссудата. Фермент супероксиддисмутаза является сильнейшим антиоксидантом, поскольку в его присутствии скорость дисмутации 02. увеличивается почти в миллион раз. Латентный период кумарин-зависимой хемилюминесценции отражает степень ингибирования свободнорадикальных реакций эндогенными антиоксидантами раневого экссудата. По интенсивности кумарин-зависимой хемилюминесценции можно судить о степени окисления и количестве липидов в субстрате. Низкие показатели интенсивности кумарин-зависимой хемилюминесценции и большой латентный период характеризуют высокое качество собственной эндогенной системы антиоксидантной защиты. Функциональная активность лейкоцитов – индикатор продукции прооксидантов, а также инициации иммунной системы, фагоцитоза, пролиферации и ангиогенеза [10]. При изучении антиоксидантной активности раневого экссудата (рис.2,3) установлена ведущая роль аскорбата в формировании мощной комбинированной антиоксидантной защиты. Так, инъекции аскорбата к 4 суткам после операции приводили к нарастанию активности супероксиддисмутазы (рис.2) и снижению уровня окисления липидов в раневом экссудате (рис.3а). Последнее, вероятно, было связано с активацией системы эндогенных антиоксидантов, т.к. латентный период кумарин-зависимой хеми-люминесценции к 4-м суткам постепенно возрастал (рис.3б). Инъекции глюкозы не вызывали эффекта активации супероксиддисмутазы (рис.2), но оказывали антиоксидантное воздействие с умеренным снижением окисления экссудата (рис.3а).
Рис.2 Изменение супероксиддисмутазной активности раневого экссудата
А0 – СОД активность на 2 сутки
А - СОД активность на 3-4 сутки
Рис.3а Изменение интенсивности собственной хемилюминесценции раневого экссудата
I0 - интенсивность свечения на 2 сутки
I - интенсивность свечения на 3-4 сутки
Рис. 3б. Изменение латентного периода собственной хемилюминесценции раневого экссудата.
Т0 – латентный период на 2 сутки,
Т – латентный период на 3 -или 4 сутки.
Рис.4 Изменение функциональной актив-ности лейкоцитов раневого экссудата.
IО - интенсивность свечения на 2 сутки ,
I - интенсивность свечения на 3-4 сутки.
Повышение функциональной активности лейкоцитов при введении глюкозы и аскорбата, отмеченное на основании увеличения продукции лейкоцитами О2. (рис.4), свидетельствовало о возрастании прооксидантного компонента свободнорадикального статуса, с помощью которого становится возможным восстановление физического и биохимического равновесия в тканях и реализация репаративной фазы воспаления. Кроме того, нарастание активности самих клеток лейкоцитарного звена указывало на интенсификацию процессов заживления.
Свободнорадикальные реакции представляют один из механизмов фазы репарации, поскольку участвуют в формировании клеточного иммунитета, способствуют выживаемости клеток в неблагоприятных ситуациях и ускоряют заживление ран [9]. Антиоксидантная и прооксидантная системы, подвижные константы свободнорадикального статуса, находятся в состоянии динамического равновесия и по-своему отражают проявление биосоциального закона единства и борьбы противоположностей. Собственный опыт использования инъекционной формы эмоксипина, одного из лидеров современных антиоксидантов, для эндоскопического лечения различных вариантов язвенной болезни не подтвердил существующую точку зрения о превалирующей роли факторов свободнорадикального окисления в патогенезе язвенной болезни и патогенети-ческом обосновании назначения антиоксидантов (эмоксипина) в терапии язвенной болезни [4]. По-видимому, установленный нами высокий метаболический эффект 5% раствора аскорбата в составе эндоскопического превентивного метаболического гемостаза был обусловлен анти- и прооксидантными свойствами (рис.2,3,4), а также иными механизмами репаративного воздействия аскорбата. Заслуживают внимания наблюдения, свидетельствующие о том, что пиковые показатели результатов влияния аскорбата на обменные [6] и биофизические процессы фиксировались к 3-4 суткам с момента введения. Этот факт является дополнительным подтверждением необходимости продолжительного использования аскорбата в лечении язвенных гастродуоденальных кровотечений, осложненных тяжелой кровопотерей и геморрагическим шоком. Известно, что при гиповолемии в случае восстановления системного, а также местного кровотока (≈ 3-4 сутки) концентрация потребляемого кислорода резко возрастает. Распад белковых структур и формирование конечных продуктов обмена пуриновых производных на фоне наступающего «кислородного (дыхательного) взрыва» при реперфузии протекают с образованием больших концентраций перекисей и супероксидных радикалов кислорода. В подобных ситуациях аскорбат выступает в роли «кислородной ловушки» [9.11]. При этом антирадикальное ингибирование осуществляется системой «глутатион-аскорбат-токоферол», транспортирующей электроны (в составе ионов водорода) от пиридиннуклеотидов к кислородным радикалам:
Участие аскорбата в регенерации токоферола обеспечивает формирование сдвоенной системы антиоксидантной защиты [11). В то же время аскорбат направляет «кислородный взрыв» и в полезное для организма русло. Интенсивное поглощение нейтрофилами витамина С сопровождается биосинтезом бактерицидных свободнорадикальных субстанций, уничтожающих предраковые клетки, бактериальные, вирусные и другие чужеродные агенты [12].Следовательно, присутствие аскорбата в тканях с признаками воспаления, деструкции и ишемии является патогенетически обоснованным и необходимым. Следует отметить особое значение аскорбата в регуляции дыхательной функции клеток. Освобождение от кислородных радикалов, а затем и от метаболитов свободнорадикального окисления, повреждающих органеллы, позволяет оптимизировать доставку кислорода в клетки. Но для восстановления кислорода в митохондриях требуется бесперебойный транспорт электронов и дополнительная энергия, к выработке которой аскорбат имеет непосредственное отношение, поскольку является донато-ром и переносчиком Н+ ионов (мощных энергоносителей) к внутренней сопрягающей мембране митохондрий. Транзит электронов по дыхательной цепи митохондрий, цитохромоксидаза, трансмембранный электрохимический потенциал ионов водорода формируют энергию, достаточную для синтеза АТР на конечном этапе окислительного фосфорилирования [13,14]. Восстановление молекулярного кислорода предполагает и регенерацию с помощью аскорбата кофермента Q (убихинона), переносчика электронов в дыхательном цикле митохондрий [10,11]. С нашей точки зрения значительное возрастание функциональной активности лейкоцитов при введении аскорбата (рис.4) косвенным образом свидетельствовало о реализации факторов защиты, улучшении дыхательной функции и, значит, жизненного потенциала не только лейкоцитов, но и других клеток организма. Как видно, мобильность Н+ ионов приобретает при гипоксии чрезвычайно важную роль. И поэтому у критических пациентов с язвенными гастродуоденальными кровотечениями, испытывающих тяжелейшую гипоксию, применение блокаторов водородной помпы в связи с депрессией ионов водорода не представляется целесообразным, согласно хемиосмотической теории окислительного фосфорилирования P. Mitchell [13,14],
Установленное в эксперименте умеренное влияние глюкозы на течение свободнорадикальных реакций не является ведущей функцией глюкозы в системе жизнеобеспечения организма. Известно, что основная роль глюкозы при тяжелых и критических состояниях - восстановление физиологического и структурного метаболизма, энергетического обмена, клеточного дыхания и нивелирование тем самым субстрата, благоприятного для свободнорадикального окисления [13]. В нашем исследовании (рис.4) постоянная функциональная активность лейкоцитов на протяжении недели (с повышением на 3 сутки) при введении глюкозы, по-видимому, отражала суть закономерности всех механизмов заживления – нормализацию дыхательной функции клеток поврежденного субстрата. В аналогичные сроки при клинико-морфологическом и экспериментальном изучении лечебного эффекта глюкозы [6] мы отметили стойкое (до 4 суток) накопление полиаминосахаридов в эпителиальных клетках, строме желудка, просвете желез и сформированной уже на 3 сутки грануляционной ткани (рис5).
Рис.5. Зрелая грануляционная ткань с множественными глыбками полиаминосахаридов PAS-реакция х 200
Очевидно, 3-4 сутки представляют начало эффективного периода реализации метаболической активности глюкозы и аскорбата. Энергия АТР, синтезированного в ходе гликолиза и фосфорилирования (т.е. при участии глюкозы и аскорбата), необходима для осуществления внутриклеточных реакций. Разобщение этих процессов пагубно для организма, а сопряжение достигается в случае их непрерывной «подпитки» в соответствии с законом К. Бернара о постоянстве внутренней среды. Только тогда происходит аккумуляция освобождающейся энергии в биологических резервуарах [6,15] и восстановление функций митохондрий, блокированных метаболитами свободнорадикального окисления [16]. Поэтому применяемый нами эндоскопический превентивный метаболический гемостаз выполняется в качестве продолженного в течение 6 суток с целью потенцирования и стабилизации местного гомеостаза [15]. Объединенный лечебный эффект ингредиентов эндоскопического превентивного метаболического гемостаза позволяет преодолеть катаболический барьер при геморрагическом шоке и уже на 3-4 сутки достигнуть формирования в язвенном дефекте неполноценных коллагено-вых волокон и признаков начальной эпителизации (рис.6)
Рис.6 Язва желудка. Начало рубцевания. Незрелые коллагеновые волокна ван Гизон х 200
По-видимому, механизмы заживления, инициированные введением аскорбата и глюкозы, носят универсальный характер. Так, выполнение метаболической коррекции при тяжелейших воспалительно-деструктивных поражениях пищевода в связи с эндоскопическим склерозированием или лигированием варикозных вен приводило к значительному уменьшению воспалительной инфильтрации тканей в «стандартные» сроки (4-5сутки) и появлению ранних признаков рубцевания дефектов на 10 сутки.
Таким образом, проведенные исследования продемонстрировали существенные нарушения свободнорадикального статуса в динамике течения раневого процесса при экспериментальном воспроизведении ран. Можно полагать, что аскорбат является одним из ведущих факторов, формирующих физиологический свободнорадикальный статус. Биофизические механизмы репаративного воздействия этого вещества, очевидно, обусловлены анти- и прооксидантной направленностью функций 5% раствора аскорбата. Но для реализации этих и других функций аскорбата у больных с метаболической недостаточностью необходим достаточный энергетический фон, который создается в случае постоянного поступления в организм субстратов энергообеспечения, одним из которых является глюкоза [13]. В связи с этим только совместное использование глюкозы и аскорбата имеет, по нашему мнению, достаточное патогенетическое обоснование и позволяет выполнить успешную местную метаболическую реа-билитацию у пациентов с различными типами воспалительно-деструктивных повреждений, обусловленных язвенными гастродуоденальными кровотечениями и последствиями эндоскопического лечения варикозно-расширенных вен пищевода при портальной гипертензии.