Форум РМС

Лечение в Москве - 8 (495) 506 61 01

Лечение за рубежом - 8 (925) 50 254 50

Культивирование двуклеточных эмбрионов мышей in vitro в среде DMEM без белка.

доимплантационные эмбрионы, культивирование in vitro, безбелковые среды.

Культивирование доимплантационных зародышей млекопитающих вне организма является необходимым звеном при проведении экспериментально-эмбриологических исследований, а также эмбриотехнологических работ по клонированию и получению трансгенных животных. Этот метод лежит в основе лечения бесплодия у людей путем экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Но хотя сам метод существует уже давно, потребности культивируемых эмбрионов и оптимальные условия для их развития in vitro окончательно не определены.

В состав питательных сред для культивирования доимплантационных эмбрионов млекопитающих входят, как правило, сыворотка или сывороточный альбумин. Однако неясным остается вопрос о необходимости этих белковых добавок, а также об их роли и функциях. До сих пор не все компоненты этих добавок точно идентифицированы, а для известных не всегда выяснено их действие на эмбрионы. Образцы этих реагентов нестандартны как по концентрации веществ, так и по их активности и их свойства изменяются по мере хранения, к тому же их использование влечет за собой угрозу вирусной контаминации зародышей.

Поэтому актуальным остаются поиск и создание определенных безбелковых сред для культивирования доимплантационных эмбрионов млекопитающих. При этом в подавляющем большинстве опубликованных работ изучалась возможность использования в качестве безбелковой среды только сложной (содержащей аминокислоты, витамины и другие компоненты) среды Хэма F-10 как одной из наиболее богатой по составу. В частности, показано, что в этой среде без каких-либо белковых добавок мышиные зародыши способны как развиваться до стадии бластоцисты [1—3], так и вылупляться из zona pellucida [4] не хуже, чем в присутствии белка. Возможность использования для культивирования доимплантационных эмбрионов млекопитающих других безбелковых сложных сред остается недостаточно изученной.

В то же время сама по себе среда Хэма F-10 не является оптимальной для культивирования доимплантационных зародышей млекопитающих in vitro. Более того, имеются сообщения о том, что один из ее компонентов — гипоксантин, может оказывать отрицательное воздействие на развитие эмбрионов мышей [5—8] и человека [9].

В настоящей работе изучалось развитие двуклеточных мышиных эмбрионов, культивируемых в более бедной по составу и не содержащей гипоксантин коммерческой культуральной среде DМЕМ (Dulbecco’s modified Eagl’s medium) без каких-либо белковых добавок.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Получение доимплантационных эмбрионов мышей. В работе использовали гибридных мышей (CBAxC57Bl)F1. Самок подсаживали к самцам той же линии на ночь и утром проверяли наличие копуляционных пробок. День обнаружения пробки считали первым днем беременности. Эмбрионы на двуклеточной стадии извлекали на второй день путем промывания яйцеводов фосфатно-буферным раствором Дюльбекко (ФБР) без белка.

Культивирование in vitro доимплантационных эмбрионов мышей. Извлеченные из яйцеводов зародыши переносили в пластиковую чашку Петри со средой культивирования. Следует отметить, что эмбрионы в среде без белка очень легко прилипают к пластиковой или стеклянной поверхности, и это затрудняет работу с ними. Поэтому после перенесения эмбрионов в чашку Петри с безбелковой средой их отмывали, перемещая некоторое время в толще среды и не давая им опуститься на дно, чтобы избежать прилипания, а затем помещали по 5—7 зародышей в стеклянные силиконизированные капилляры [4, 10]. Объем культуральной среды в капилляре составлял около 20 мкл. Капилляры заполняли таким образом, чтобы на концах оставались пузырьки воздуха. Затем капилляры помещали в стеклянные флаконы под слой парафинового масла (“Fluka”, Швейцария) во избежание испарения среды. Качество масла и его стерильность при этом не имеют значения, так как пузырьки воздуха препятствуют контакту масла со средой. Флаконы заполняли трехкомпонентной газовой смесью (5% CO2, 5% O2 и 90% N2), плотно закрывали, опускали в сосуд с водой и помещали в термостат при 37°С. Через 72 ч культивирования подсчитывали число бластоцист, а через 96 ч число вылупившихся бластоцист. Вылупившимися считали только эмбрионы, полностью вышедшие из zona pellucida.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием критерия Стьюдента.

Культуральные среды и реагенты. Использовали ФБР (“Юрьевецветбиопрепарат”, Россия), жидкие питательные среды Хэма F-10 (“Serva”, Германия) и DMEM (“Flow”, Англия), фетальную коровью сыворотку (ФКС) (“Flow”, Англия).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Полученные от нескольких мышей эмбрионы случайным образом разделяли на экспериментальные группы. Зародыши культивировали в среде DМЕМ без белка (1-я группа; n = 28), в среде DМЕМ с 20% ФКС (2-я группа; n = 21), в среде Хэма F-10 без белка (3-я группа; n = 76) или в среде Хэма F-10 c 20% ФКС (4-я группа; n = 96).

В 1-й группе через 72 ч культивирования 89,3% эмбрионов достигли стадии бластоцисты, во 2-й группе 95,2%, в 3-й группе — 93,4% и в 4-й группе — 92,7%. Через 96 ч в 1-й группе вылупилось из zona pellucida 53,6% от общего числа эмбрионов, во 2-й группе — 52,4%, в 3-й группе — 63,2% и в 4-й группе — 59,4%. Различия между группами везде недостоверны.

Таким образом, из наших экспериментов следует, что двуклеточные эмбрионы мышей способны успешно развиваться до бластоцисты и вылупляться из zona pellucida в среде DМЕМ без добавления какого-либо белка. При этом процент развития был не хуже, чем в среде DМЕМ с 20 % ФКС и в среде Хэма F-10 как без белка, так и с добавлением сыворотки.

Следует отметить, что в средах с сывороткой практически все образовавшиеся в результате культивирования и вышедшие из zona pellucida бластоцисты прикреплялись к стеклянной поверхности капилляра, после чего шло разрастание по стеклу клеток трофэктодермы и формирование хорошо видимого узелка из клеток внутренней клеточной массы. В то же время в средах без сыворотки ни в одном из случаев не наблюдалось прикрепления вылупившихся бластоцист и разрастания клеток.

ОБСУЖДЕНИЕ

Включение сыворотки или сывороточного альбумина в состав культуральных сред может приводить к ухудшению результатов культивирования. Причины такого отрицательного действия белковых добавок на доимплантационные эмбрионы млекопитающих до конца не ясны, при этом они, вероятно, не сводятся к качеству различных партий самих реагентов. Так, эмбриотоксичность сыворотки может зависеть от физиологического состояния донора крови, причем отмечена связь с состоянием его репродуктивной системы. В частности, сообщалось о токсическом влиянии на культивируемые in vitro зародыши мышей сыворотки крови женщин, страдающих эндометриозом [11—13] и повторяющимися спонтанными абортами [14].

В этой связи в настоящее время ведется поиск сред, в которых зародыши могли бы развиваться без добавления сыворотки или белка. Внимание исследователей в первую очередь привлекла сложная, одна из наиболее богатых по составу, содержащая аминокислоты, витамины и другие добавки среда Хэма F-10. Это связано и с ее широким применением для оплодотворения in vitro ооцитов человека и культивирования эмбрионов человека и сельскохозяйственных животных. В качестве модели для изучения возможности использования этой среды без каких-либо белковых добавок используют, как правило, мышиные зародыши. Данных же по культивированию эмбрионов в других сложных средах без добавления белка крайне мало.

Вместе с тем коммерческая среда Хэма F-10 наряду с другими компонентами содержит природное производное пурина — гипоксантин, который в живых организмах является промежуточным продуктом катаболизма пуриновых оснований. Однако во многих работах показано, что гипоксантин оказывает отрицательное влияние на развитие двуклеточных мышиных зародышей in vitro [9], а при культивировании in vitro зигот мышей некоторых линий гипоксантин может блокировать их развитие на первых делениях дробления [5—8]. Гипоксантин может оказывать отрицательное воздействие и на гаметы человека, выражающееся в снижении оплодотворяемости яйцеклеток и увеличении частоты цитоплазматической фрагментации эмбрионов [9]. При этом исключение гипоксантина из среды Хэма F-10 похоже улучшает результаты культивирования зигот человека в этой среде [15].

Установлено также блокирующее действие гипоксантина на мейотическое созревание ооцитов крыс [16] и мышей [17]. Этот факт представляет практический интерес, поскольку содержащая гипоксантин среда Хэма F-10 используется и для дозревания in vitro яйцеклеток человека в программах ЭКО [18, 19].

Возможно поэтому в последнее время стали появляться работы по культивированию доимплантационных эмбрионов млекопитающих в других сложных средах. В частности, в более простой по составу, чем среда Хэма F-10, и не содержащей гипоксантин среде альфа-МЕМ. Оказалось, что эмбрионы инбредных мышей лучше развивались in vitro в этой среде, чем в среде Хэма F-10 [20]. Были также достигнуты хорошие результаты при культивировании эмбрионов человека в среде альфа-МЕМ с различными белковыми добавками [21, 22].

Полученные в настоящей работе результаты показывают, что относительно близкая по составу к среде альфа-МЕМ и также не содержащая гипоксантин среда DMEM способна обеспечивать развитие двуклеточных мышиных эмбрионов in vitro вплоть до вылупления без каких-либо белковых добавок. При этом результаты культивирования в безбелковой среде DMEM достоверно не отличались от результатов культивирования как в среде Хэма F-10 без белка, так и в среде DMEM с 20% ФКС, т.е. белок не является необходимым компонентом при культивировании эмбрионов мышей в среде DМЕМ. Однако требуются дополнительные исследования для выяснения возможности использования среды DМЕМ без белка для культивирования ранних доимплантационных эмбрионов других видов млекопитающих.

В последние годы стали появляться работы по культивированию доимплантационных эмбрионов разных видов млекопитающих в различных сложных безбелковых средах. Интересно, что при культивировании кроличьих зигот в смеси сред DMEM—RPMI 1640 (1:1) без белка они развивались достоверно лучше, чем в безбелковой среде 199, которая существенно богаче и содержит намного больше компонентов, чем указанная смесь. Добавление белка к среде 199 улучшало результаты, и авторы предположили, что белок возможно связывает некоторые “лишние” компоненты, устраняя, таким образом, их отрицательный эффект [27]. К числу таких “лишних” для доимплантационных эмбрионов млекопитающих компонентов помимо гипоксантина относится, возможно, и никотинамид, входящий в состав многих сложных коммерческих культуральных сред. На это указывает работа, в которой было показано отрицательное влияние никотинамида на культивируемые in vitro мышиные эмбрионы [28].

Способность сформировавшихся in vitro бластоцист вылупляться in vitro из zona pellucida является достаточно строгим критерием, позволяющим судить о полноценности этих бластоцист, а следовательно, и о качестве культуральных сред. В то же время некоторые авторы предлагают использовать для оценки жизнеспособности зародышей способность вылупившихся бластоцист прикрепляться к субстрату, формировать выраженную внутреннюю клеточную массу и давать разрастание клеток трофэктодермы [3, 23]. Ранее было показано, что процесс прикрепления также зависит от наличия некоторых аминокислот, однако в использовавшихся в этих опытах средах присутствовала и сыворотка [24]. Мы в своих опытах не наблюдали прикрепления вылупившихся бластоцист к стеклу и разрастания клеток в безбелковых средах, как это имело место в средах с сывороткой. Подобный факт был отмечен при культивировании эмбрионов мышей в среде ВSM-2, представляющей собой солевой раствор с добавлением ряда аминокислот и витаминов, без белка [25]. Таким образом, для прикрепления и разрастания клеток, в отличие от вылупления, необходимо наличие в культуральной среде белка. Вместе с тем сообщалось, что вылупившиеся бластоцисты способны прикрепляться и давать разрастание по поверхности полистереновых чашек Петри в среде Хэма F-10 без белка [26]. Вероятно, эти процессы зависят и от физико-химических свойств поверхности разрастания.

Изучение развития зародышей млекопитающих в химически определенных безбелковых средах углубляет наши знания о доимплантационном эмбриогенезе, а с практической точки зрения способствует созданию более эффективных систем культивирования ранних зародышей млекопитающих in vitro. Наши результаты свидетельствуют о перспективности использования среды DМЕМ в качестве безбелковой среды для культивирования доимплантационных эмбрионов млекопитающих при проведении как экспериментальных, так и практических работ.

Л.И. Вильянович, А.С. Кривохарченко
Всероссийский НИИ физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных РАСХН, Боровск, Калужская область

Литература

1. Shirley B., Wortham E.J., Witmyer J. et al. Effects of human serum and plasma on development of mouse embryos in culture media. Fertil Steril 1985; 43: 1: 129—134.
2. Kruger T.F., Stander F.S.H., Smith K., Lombard C.J. The development of one- and two-cell mouse embryos in the absense of human serum. S Afr Med J 1986; 70: 9: 542—543.
3. Dandekar P.V., Glass R.H. Development of two-cell mouse embryos in protein-free and protein-supplemented media. J in vitro Fertil Embryo Trans 1990; 7: 2: 107—113.
4. Кривохарченко А.С., Вильянович Л.И., Татаринова Л.В., Рябых В.П. Развитие мышиных эмбрионов in vitro в среде без белка в зависимости от количества зародышей в микрообъеме среды. Онтогенез 1993; 24: 6: 53—60.
5. Loutradis D.K., John D., Kiessling A.A. Hypoxanthine causes a 2-cell block in random-bred mouse embryos. Biol Reprod 1987; 37: 311—316.
6. Downs S.M., Dow M.P.D. Hypoxanthine-maintained two-cell block in mouse enbryos: dependence on glucose and effect of hypoxanthine phosphoribosyltransferase inhibitors. Biol Reprod 1991; 44: 6: 1025—1039.
7. Dienhart M.K., Downs S.M. Cyclic AMP rerversal of hypoxantine-arrested preimplantation mouse embryos is EDTA-dependent. Zygote 1996; 4: 2: 129—137.
8. Dienhart M.K., OўBrien M.J., Downs S.M. Uptake and salvage of hypoxantine mediates developmental arrest in preimplantation mouse embryoa. Biol Reprod 1997; 56: 1: 1—13.
9. Bastias M.C., Mcgeebelser S.T., Bryan S.H., Vasquez J.M. in vitro deleterious effect of hypoxantine in Ham nutrient mixture F-10 culture medium on human oocyte fertilization and early embryonic development. Fertil Steril 1993; 60: 5: 876—880.
10. Кривохарченко А.С., Бахитов К.И., Вильянович Л.И., Рябых В.П. Система культивирования 8-клеточных эмбрионов мыши для тестирования среды Дюльбекко и сывороток, используемых при трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных. Сельскохозяйственная биология, сер Биол животн 1994; 2: 53—56.
11. Damewood M.D., Hesla J.S., Sahlaff W.D. et al. Effect of serum from patients with minimal to mild endometriosis on mouse embryo development in vitro. Fertil Steril 1990; 54: 5: 917—920.
12. Abu-Musa A., Takahashi K., Kitao M. Effect of serum from patients with endometriosis on the development of mouse embryos. Gynecol Obstet Invest 1992; 33: 3: 157—160.
13. Ito F., Fujino Y., Ogita S. Serum from endometriosis patients impairs the development of mouse embryos in vitro-comparison with serum from tubal obsruction patient and plasmanate. Acta Obstet Gynecol Scand 1996; 75: 10: 877—880.
14. Thomason E.J., Roussev R.G., Stern J.J., Coulam C.B. Prevalence of embryotoxic factor in sera from women with unexplained recurrent abortion. Am J Reprod Immunol 1995; 34: 6: 338—341.
15. Loutradis D.K., Kiessling A.A., Kallianidis K., Siskos K., Creatsas G., Michalas S., Aravantinos D. A preliminary trial of human zygote culture in Ham’s F-10 without hypoxanthine. J Assist Reprod Genet 1993; 10: 4: 271—275.
16. Daniel A.J., Armstrong T.D., Gore-Langton R.E. Growth and development of rat oocytes in vitro. Gamete Res 1989; 24: 1: 109—121.
17. Downs S.M. Hypoxantine regulation of oocyte maturation in mouse: insights using hypoxanthine phosphoribosyltransferase-deficient animals. Biol Reprod 1997; 57: 1: 54—62.
18. Dandekar P.V., Martin M., Glass R.H. Maturation of immature oocytes by coculture with granulosa cells. Fertil Steril 1991; 55: 1: 95—99.
19. Kwang Yul Cha, Jung Jin Koo, Jung Jae Ko, Dong Hee Choi, Sei Yul Han, Tae Ki Yoon. Pregnancy after in vitro ferilization of human follicular oocytes collected from nonstimulated cycles, their culture in vitro abd their transfer in donor oocyte program. Fertil Steril 1991; 55: 1: 109—113.
20. Roudebush W.E., Often N.L., Butler W.J. Alpha-minimum essential medium (MEM) enhances in vitro hatched blastocyst and cell number per embryo over Ham’s F-10. J Assist Reprod Genet 1994; 11: 4: 203—207.
21. Noda Y., Shiotani M., Goto Y., Nakagama T., Umaoka Y., Mori T. Culture of human embryos in alpha modification of Eagl’s medium under low oxygen tension and low illumination. Fertil Steril 1994; 62: 5: 1022—1027.
22. Desai N., Kinzer D., Loeb A., Goldfarb J. Use of synthetic serum substitute and alpha-minimum essential medium for the extended culture of human embryos to the blastocyst stage. Hum Reprod 1997; 12: 2: 328—335.
23. Chida S., Mettler L. Screening test for mouse blastocysts as an index of the vitality of embryos. J in vitro Fertil Embryo Trans 1989; 6: 5: 310—312.
24. Gwatkin R.B.L. Amino acid requirements for attachment and outgrowth of the mouse blastocyst in vitro. J Cel Physiol 1966; 68: 3: 335—343.
25. Schneider U. in vitro development and hatching of mouse embryos in protein-free medium. Theriogenology 1986; 25: 1: 196.
26. Findley W.E., Gibbons W.E. Protein supplementation is not required for in vitro preimplantation or blastocyst attachment and outgrowth in uncoated polystyrene dishes. Biol Reprod 1988; 38: Suppl 1: 76.
27. Carney E.W., Foote R.H. Improved development of rabbit one-cell embryos to the hatching blastocyst stage by culture in a defined, protein-free culture medium. J Reprod Fertil 1991; 91: 1: 113—123.
28. Tsai F.C., Gardner D.K. Nicotinamide, a component of complex cultire media, inhibits mouse embryo development in vitro and reduces subsequent developmental potential after transfer. Fertil Steril 1994; 61: 2: 376—382.