Введение
Сероводород (регистрационный номер CAS 7783-06-4) входит наряду с другими менее токсичными компонентами в состав природного газа ряда газоконденсатных месторождений. Сероводород является побочным продуктом многих технологических процессов в нефтехимической промышленности, на коксохимических предприятиях, предприятиях по производству вискозного волокна, целлофана, солей бария, серосодержащих красок и пигментов, на фабриках по изготовлению литографий и фотогравюр, на сахарных и кожевенных заводах, на предприятиях по очистке сточных вод. Кроме того, сероводород применяется в качестве промежуточного продукта при синтезе неорганических и органических соединений серы [2].
Изучение острого отравления сероводородом, который относится к веществам II класса опасности, проводится достаточно широко, хотя случаев острого отравления сероводородом людей, к счастью, сравнительно немного. В то же время хроническому воздействию сероводородом подвергается значительное число людей, а работ, рассматривающих возможные последствия такого воздействия, крайне мало [11]. Вопрос о влиянии длительного воздействия малых доз сероводорода на важнейшую из биологических функций - репродуктивную функцию как в отечественной, так и в зарубежной литературе практически не освещен, хотя при пучении последствий воздействия химических веществ одной из приоритетных задач является оценка гонадотоксического действия [13, 16].
Газовый конденсат Астраханского месторождения отличается уникально высоким (более 30%) содержанием сероводорода, который является ведущим токсикантом среди других компонентов газового конденсата. Экспериментальное изучение влияния природного газа Астраханского газоконденсатного месторождения (АГКМ) на репродуктивную функцию стало целью настоящей работы.
Материалы и методы
Беспородные белые 5-6-месячные крысы массой тела 180-240 г, содержавшиеся на стандартной диете, были разделены на две группы: контрольную (К) и опытную (О). В группу К вошло 59 животных (42 самки и 27 самцов), в группу О - 110 животных (46 самок и 64 самца).
Животные группы О в течение 30 дней по 4 ч ежедневно подвергались воздействию природного газа АГКМ в камере для токсикологических экспериментов. Концентрация природного газа в атмосфере камеры поддерживалась на уровне 10 мг/м3 (доза 10 мг/м3 выбрана как соответствующая ПДК по сероводороду [14, 15]). После окончания затравки проводили спаривание животных в течение 20 дней: 19 самок К с 7 самцами К (1-я группа), 22 самки О с 8 самцами К (2-я группа), 23 самки К с 8 самцами О (3-я группа) и 24 самки О с 9 самцами О (4-я группа).
Состояние сперматогенеза у самцов группы О оценивали по методу В.П. Маминой и Д.И. Семенова [6] каждые 7 дней в течение 35 дней после окончания воздействия сероводородсодержащего газа. Для повышения точности дифференцировки сперматогенных клеток проводили реакцию на гликоген [7]. Также каждые 7 дней в течение 35 дней исследовали суспензию эпидидимиса (учитывались общее количество, морфологические и кинетические характеристики, жизнеспособность эпидидимальных сперматозоидов) с использованием общепринятых методик [3, 12]. Определение числа клеток в счетной камере проводилось с учетом свойств распределения Пуассона [1]. Исследование выполнялось на микроскопе "Axioskop" с МC-80 фирмы "Karl Zeiss Jena GmbX". Как показывают наши исследования [4, 9, 10], определение активности ферментов является весьма информативным методом для оценки функционального состояния репродуктивной системы. Поэтому параллельно в гомогенате семенников определяли активность 3b-гидроксистероиддегидрогеназы (3b-ГСД) - одного из основных ферментов биосинтеза тестостерона. Для измерения активности 3b-ГСД применяли спектрофотометрический метод Рубина в модификации Голдмана [5]. Гомогенаты семенников после инкубации с 50 мкг дигидроэпиандростерона (3b-гидpoкcи-5-aндpocтeн-17-он) в 0,05 мл пропиленгликоля, 4,5 мкМ НАД и равными частями 0,9% раствора NaCl и 0,15 М фосфатного буфера рН 7,2 в постоянном объеме 2 мл. Подсчет образовавшегося продукта (4-кетостероидной формы) производили в этилацетатном экстракте инкубата при длине волны 302 нм, читали против стандартного раствора андростендиона (андростен-4-дион-3,17). Все измерения были продублированы трехкратно. Пустые пробы были подготовлены как опытные образцы, но без добавления субстрата. Активность 3b-ГСД выражали в условных единицах (усл. ед.). 1 усл. ед. = 1 мкг образовавшегося за 90 мин продукта / 1 г ткани семенника. Анализ полученных результатов произведен с использованием ПЭВМ "SUNRISE - Pentium-233MMX".
Результаты и обсуждение
Хроническое воздействие природного газа приводит к выраженному нарушению репродуктивного здоровья. Так, во 2-й группе количество мертворожденных увеличилось более чем в 5 раз (до 14,8±1,1%) по сравнению с 1-й группой (2,8±0,3%), а количество выживших в течение 10 дней постнатального периода снизилось (до 67,0±4,75%) по сравнению с 1-й группой. В 3-й группе нарушения были выражены более резко. Среднее число плодов снизилось в 2 раза (до 4,25±0,45) по сравнению с 1-й группой (8,6±0,85), количество мертворожденных возросло в 10 раз (до 29,4±0,95%) по сравнению с 1-й группой и почти в 2 раза по сравнению со 2-й группой. Количество выживших в течение 10 дней постнатального периода снизилось в 2 раза (до 35,3±1,2%) по сравнению с 1-й группой, т.е. число выживших в 3-й группе составило чуть больше одной трети от всех живорожденных. В 4-й группе наступление беременности не зарегистрировано, хотя рекреативное поведение животных было сохранено (табл. 1). Значительно более сильно пострадала репродуктивная функция самцов (3-я группа) по сравнению с самками (2-я группа), это побудило нас провести углубленное изучение влияния хронического воздействия природного газа на генеративную систему самцов.
Таблица 1. Показатели репродуктивной функции крыс после хронического воздействия природного газа АГКМ
|
Группа экспериментальных животных
|
Показатель репродуктивного здоровья
|
1-я (самки n=19, самцы n=7)
|
2-я (самки n=22, самцы n=8)
|
4-я (самки n=23, самцы n=8)
|
4-я (самки n=24, самцы n=9)
|
Среднее число плодов
|
8,6±0,85
|
7,75±0,82
|
4,25±0,45
|
0
|
Мертворожденные, %
|
2,8±0,3
|
14,8±1,1
|
29,4±0,95
|
0
|
Выжившие, %
|
76,5±4,2
|
67,0±4,75
|
35,3±1,2
|
0
|
|
При анализе состояния сперматогенеза у крыс на 7-й день после прекращения воздействия сероводородсодержащего газа, отмечено резкое уменьшение общего количества сперматогенных клеток в семеннике - более чем в 7 раз (до 700±220 млн.) по сравнению с контролем (5236±470 млн. клеток). Постепенно происходило восстановление общего количества сперматогенных клеток (14-й день - 1890±290 млн., 21-й день - 3340±355 млн.), завершившееся к 28-му дню (5406±488 млн., табл. 2).
Таблица 2. Состояние сперматогенеза у крыс в норме и после хронического воздействия природного газа АГКМ
Тестикулярные показатели сперматогенеза
|
Время после окончания затравки
|
|
Контроль
|
7 дней
|
14 дней
|
21 день
|
28 дней
|
35 дней
|
|
(n=12)
|
(n=9)
|
(n=9)
|
(n=9)
|
(n=9)
|
(n=11)
|
Общее количество сперматогенных клеток, Ѕ106
|
5236±470
|
700±220
|
1890±290
|
3340±355
|
5406±488
|
5600±510
|
Сперматогонии, %
|
23,7±1,9
|
14,3±1,4
|
12,7±1,3
|
21,5±1,9
|
20,8±1,9
|
20,7±2,0
|
Сперматоциты, %
|
20,0±2,1
|
28,6±2,5
|
6,3±0,7
|
14,4±1,5
|
15,7±1,6
|
19,3±1,9
|
Сперматиды, %
|
21,5±2,2
|
35,7±3.,1
|
17,5±1,6
|
19,2±1,9
|
20,1±2,1
|
20,0±2,2
|
Сперматозоиды,%
|
34,8±2,8
|
21,4±1,8
|
63,5±4,2
|
44,9±3,7
|
43,4±3,6
|
40,0±3,8
|
|
Восстановление нормального соотношения между разными типами сперматогенных клеток (сперматогонии, сперматоциты, сперматиды, сперматозоиды) происходило более медленно и завершилось к 35-му дню после окончания затравки (см. табл. 2).
Исследование придатка семенника на 7-й день после окончания затравки показало снижение общего количества эпидидимальных сперматозоидов более чем в 1,5 раза (до 866±82 млн.) по сравнению с контролем (1425±155 млн.). Восстановление общего количества эпидидимальных сперматозоидов протекало достаточно быстро и заканчивалось к 14-21-му дню после окончания воздействия сероводородсодержащего газа (табл. 3).
Таблица 3. Состояние эпидидимальных сперматозоидов у крыс в норме и после хронического воздействия природного газа АГКМ
Тестикулярные показатели сперматогенеза
|
Время после окончания затравки
|
|
Контроль
|
7 дней
|
14 дней
|
21 день
|
28 дней
|
35 дней
|
|
(n=12)
|
(n=9)
|
(n=9)
|
(n=9)
|
(n=9)
|
(n=11)
|
Общее количество сперматозоидов, Ѕ106
|
1425±155
|
866±82
|
1240±170
|
1341±151
|
1396±188
|
1430±210
|
Дефективные сперматозоиды, %
|
1,1±0,2
|
44,4±3,8
|
31,8±2,3
|
9,0±1,0
|
5,2±0,8
|
3,9±0,7
|
Подвижные сперматозоиды, %
|
88,0±6,2
|
0,35±0,1
|
1,9±0,3
|
17,0±1,9
|
48,3±5,1
|
76,8±8,4
|
Мертвые сперматозоиды,%
|
4,8±0,82
|
55,2±4,4
|
18,4±2,5
|
6,7±1,2
|
6,2±1,2
|
5,5±0,9
|
|
При оценке состояния эпидидимальных сперматозоидов выявлены серьезные морфо-функциональные нарушения: резкое увеличение процентного содержания дефективных форм сперматозоидов, снижение подвижности, увеличение процентного содержания мертвых сперматозоидов. Так, на 7-й день, после окончания воздействия природного газа отмечалось увеличение количества сперматозоидов с морфологическими дефектами в 40 раз (до 44,4±3,8%) по сравнению с контролем (1,1±0,2%), подвижные сперматозоиды практически полностью отсутствовали (0,35±0,1%) по сравнению с контролем (88,0±6,2%). Также почти в 11,5 раз увеличивалось количество мертвых сперматозоидов (до 55,2±4,4%) по сравнению с контролем (4,8±0,82%). Восстановление изучаемых показателей происходило разными темпами. Если восстановление нормального количества живых сперматозоидов завершалось к 21-му дню (6,7±1,2% мертвых сперматозоидов), то восстановление количества подвижных сперматозоидов (76,8±8,4%) происходило к 35-му дню, а повышенное количество сперматозоидов с дефектами (3,9±0,7%) наблюдалось и на 35-й день после окончания воздействия природного газа (см. табл. 3).
Определение тестостеронпродуцирующей активности семенников, т.е. функционального состояния клеток Лейдига [18, 19], показало снижение в семенниках активности 3b-ГСД на 7-й день после окончания воздействия природного газа более чем в 2 раза (до 102,0±22,5 усл. ед. по сравнению с контролем (236,2±29,3 усл. ед.). Восстановление активности 3b-ГСД до нормы происходило к 21-му дню (до 198,4±20,6 усл. ед.; (см. рисунок).
Анализ полученных результатов позволил сделать некоторые выводы о механизмах гонадотоксического действия природного газа.
В целом хроническое воздействие сероводородсодержащего природного газа крайне неблагоприятно сказывается на функциональном состоянии репродуктивной системы крыс, что подтверждается ухудшением генеративных показателей во 2-й и 3-й группах по сравнению с 1-й группой и инфертильностью в 4-й группе. Снижение среднего числа плодов у крыс 3-й группы обусловлено ухудшением оплодотворяющей способности эякулята после хронического воздействия природного газа. Субфертильность может проявляться нарушением нормального функционирования ферментативных систем спермоплазмы [4, 10] и (или) нарушением интерполимерного комплексообразования белками спермоплазмы [8, 9], обусловленным сероводородом и его метаболитами (сульфатами, тиосульфатами) [2], т.е. нарушением биохимического гомеостаза спермоплазмы.
Также субфертильность может быть обусловлена нарушением генетического аппарата сперматозоидов, вызванным сероводородом и (или) его метаболитами. Подтверждением этому может служить, на наш взгляд, значительное увеличение количества мертворожденных и уменьшение количества выживших в течение 10 дней постнатального периода (см. табл. 1). Можно констатировать также наличие отдаленных последствий [13, 16] воздействия природного газа на крыс.
Наряду с этим возможно отрицательное воздействие природного газа и его метаболитов па процесс сперматогенеза, на молекулярную структуру сперматозоидов и на метаболические пути биосинтеза основного тестикулярного гормона - тестостерона.
Снижение общего количества сперматогенных клеток в семеннике свидетельствует о цитотоксическом действии сероводорода и (или) его метаболитов на сперматогонии. Однако это не может объяснить изменения соотношения между разными типами сперматогенных клеток.
Причина такого дисбаланса, на наш взгляд, лежит в различной чувствительности звеньев сперматогенеза к воздействию токсиканта [16, 17]. Наиболее чувствительным является уровень образования сперматогонии А, который угнетается в начальные сроки хронического воздействия природного газа (блок I). Позднее происходит торможение процесса дифференцировки сперматид в сперматозоиды (блок II). Более устойчивым оказывается этап перехода сперматоцитов в сперматиды, который поражается к концу срока затравки (блок III).
Молекулярные механизмы воздействия природного газа на процессы дифференцировки сперматогенных клеток остаются неизученными, и можно только предполагать взаимодействие сероводорода и (или) его метаболитов с рецепторным аппаратом клеток-мишеней. Единственным конкретным указанием на механизм действия сероводорода является резкое снижение активности 3b-ГСД, свидетельствующее о нарушение синтеза тестостерона, который в свою очередь контролирует несколько этапов процесса сперматогенеза, в частности редукционное деление мейоза [18, 19].
Интересно, что снятие блоков после окончания воздействия природного газа происходило, вероятно, в порядке, обратном времени их появления. Так, с 7-го по 14-й день после окончания затравки был снят сначала III блок, что совпадает с процессом восстановления нормальной активности 3b-ГСД. Затем был снят и II блок, в результате в 2 раза уменьшилось относительное количество сперматид за счет перехода в сперматозоиды (относительное содержание сперматозоидов возросло почти в 3 раза). К 21-му дню был снят I блок, что привело к увеличению относительного количества сперматогоний за счет увеличения возврата в стабильный пул сперматогоний типа А.
Соотношение между сперматогониями, сперматоцитами, сперматидами и сперматозоидами, нарушенное воздействием природным газом, восстанавливалось только через 35 дней, хотя восстановление активности 3b-ГСД в среднем закончилось уже к 21-28-му дню после затравки. Возможно активность 3b-ГСД ингибируется сероводородом или его метаболитами, так как известна ингибирующая активность сероводорода по отношению к некоторым ферментам [2, 4], например, сероводород ингибирует цитохромоксидазу.
Таким образом, хроническое воздействие природного газа приводит к ряду серьезных нарушений репродуктивной функции крыс, причем нарушения более выражены у самцов. Анализ полученных данных выявил несколько возможных механизмов гонадотоксического действия сероводорода и (или) его метаболитов. Хроническое воздействие природного газа приводит к отдаленным последствиям, связанным с поражением половых клеток. Субфертильность самцов может быть связана также с нарушением биохимического гомеостаза спермоплазмы. Сероводород и (или) его метаболиты способны оказывать цитотоксическое действие, вызывающее гибель сперматогоний, а также блокирующее воздействие на восполнение стабильного пула сперматогоний типа А, на процесс дифференцировки сперматид в сперматозоиды, на процесс мейоза (вероятнее всего на редукционное деление). Блок процесса мейоза, вероятно, связан с угнетением синтеза тестостерон, вызванным снижением активности фермента биосинтеза тестостерона 3b-ГСД, который ингибируется сероводородом и (или) его метаболитами.
Д.Л. Луцкий, А.А. Николаев, Л.А. Гончарова, M.В. Ушакова
Кафедра общей и биоорганической химии (зав. - доктор мед. наук, проф. А.А. Николаев), Астраханской государственной медицинской академии
Литература
1. Бенюмович М.С. Определение числа клеток в счетной камере с учетом свойств распределения Пуассона. Клинич лаб диагностика 1997; 6: 11-12.
2. ВОЗ. Раннее выявление профессиональных болезней. Женева 1988.
3. Луцкий Д.Л., Николаев А.А. Морфологическое исследование эякулята: Методическое пособие. Астрахань 1999.
4. Луцкий Д. Л. Иммунохимическая и биохимическая характеристика спермоплазмы субфертильных мужчин: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Москва 2000.
5. Луцкий Д.Л., Ушакова М.В. Активность 3b-гидроксистероиддегидрогеназы семенников крыс как показатель сперматогенной функции при воздействии неблагоприятных экологических факторов. В кн.: Научная конференция НИИ и медицинских вузов Поволжья и Северного Кавказа: Тез докл. Нижний Новгород 2000; 21-22.
6. Маиина В.П., Семенов Д.И. Метод определения количества сперматогенных клеток семенника в клеточной суспензии. Цитология 1976; 7: 913-915.
7. Микроскопическая техника. Под ред. Д.С. Саркисова, Ю.Л. Перова. Москва 1996.
8. Николаев А.А., Аншакова Н.И., Алтухов С.А. Образование интерполимерных комплексов белками семенной плазмы. Вопр мед химии 1990; 4: 98-101.
9. Николаев А.А. Биохимическое и иммунохимическое изучение белков семенной плазмы человека: Автореф. ... д-ра мед. наук. Москва 1994.
10. Николаев А.А., Луцкий Д.Л., Бочановский В.А., ЛожкинаЛ.В. Активность ферментов спермоплазмы в эякулятах различной фертильности. Урол и нефрол 1997; 5: 35-39.
11. Николаев А.А., Луцкий Д.Л. Влияние экологических факторов на репродуктивную функцию мужчин. В кн.: Эколого-физиологические проблемы адаптации: Тез докл. Москва 1998; 79-80.
12. Николаев А.А., Луцкий Д.Л. Биологическое и биохимическое исследование эякулята: Методическое пособие. Астрахань 1999.
13. Нугис В.Ю., Строкина А.Н. Отдаленные последствия воздействия опасных и вредных экологических факторов на человека. В кн.: Воздействие на организм человека опасных и вредных экологических факторов: Том 2. Москва 1997; 350-420.
14. Предельно допустимые концентрации вредных веществ в воздухе рабочей зоны. Под ред. Н.Ф. Измерова. Москва 1991.
15. Справочник предельно допустимых концентраций вредных веществ в пищевых продуктах и среде обитания. Под ред. М.П. Беляева. Москва 1993.
16. Bujan L. Environnement et spermatogenese. Contracept Fertil Sex 1998; 26(1): 39-48.
17. Hecht N.В. Molecular mechanisms of male germ cell differentiation. Bioessays 1998; 20(7): 555-561.
18. de Kretser D.М., Loveland K.L., MeinhardtA. et al. Spermatogenesis. Hum Reprod 1998; 13: 1-8.
19. Shan L.X., Bardin C.W., Hardy М.P. Immunohistochemical analysis of androgen effects on androgen receptor expression in developing Leydig and Sertoli cells. Endocrinology 1997; 138(3): 1259-1266
|
