Криоконсервирование спермы донора
|
Одним из важных условий для успешного консервирования органов, тканей, клеток является исходное состояние будущего трансплантационного материала. В частности, при оценке исходного состояния эякулята, подготавливаемого для низкотемпературного консервирования, необходимо обратить внимание на следующие параметры: подвижность спермиев, их число в образце, переживаемость в течение 1-2 ч, морфологические характеристики спермиев, а также определить содержание акрозина, a-фетоглобулина фертильности и криоустойчивость гамет. В связи с возрастанием числа патологии, влияющей на репродуктивную функцию мужчин (ионизирующее излучение, физико-химические факторы, стрессы, инфекционные и онкологические заболевания и пр.), в некоторых случаях возникает необходимость использования спермы донора. Цель настоящего исследования - изучить влияние сред замораживания и отогрева на морфокинетические показатели спермиев человека при криоконсервировании их простым и доступным методом.
Материал исследования Материалом исследования служили эякуляты, полученные у 44 мужчин в возрасте до 40 лет после 3-4-дневной половой абстиненции. Пробы собирали в стерильные чашки Петри или бюксы. Разжижение образцов происходило при 37°С в течение 30-60 мин. Морфологические повреждения оценивали в мазках, окрашенных эозин-нигрозином. Оценку спермокинезисграммы проводили компьютерным методом (CASA) на микроскопе Оlimpus SH-40 c программным обеспечением «Видеотест-4». С целью защиты спермиев на этапе криоконсервирования к эякуляту добавляли одну из исследуемых криопротекторных сред: 1. глицерино-желточную среду (ГЦЖ); 2. глицерин (10%), цитрат натрия, сахарозу; 3. ГЦЖ после центрифугирования. Были использованы две различные контролируемые скорости замораживания спермиев человека. В первой серии экспериментов замораживание проводили в открытой системе. Образцы, расфасованные в стерильные пластиковые апирогенные нетоксичные трубочки по 0,7-0,8 мл, герметично запаянные, помещали в ультратермостат и охлаждали со скоростью 1-2°С/мин до 10°С/мин, затем переносили в алюминиевый контейнер и продолжали охлаждение со скоростью 70°С/мин в течение 1 мин, после чего образцы погружали в жидкий азот. Во второй серии использовали замораживающую камеру УП-2 (СКБ Института проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины) с программным управлением. Замораживание проводили по 3-этапной программе с теми же скоростями замораживания. Трубочки маркировали и хранили в пластиковых контейнерах с завинчивающейся крышкой. Для размораживания использовали водяную баню 37°С/мин. После отогрева образцы спермы отмывали от криопротектора в среде Хенкса и проводили оценку жизнеспособности спермиев. Результаты и обсуждение Наилучшие результаты были получены при использовании среды 3 (51,7±3,0 млн/мл, группа a+b - 50%, при р<0,05). Однако при использовании криоконсервированной спермы в программе оплодотворения вне организма (ОВО), даже при тщательной отмывке, не удается избавиться от лецитиновых зерен желтка, что, по-видимому, влияет на условия культивирования. Учитывая это обстоятельство, мы использовали безжелточную среду, содержащую глицерин и сахарозу. После наслоения среды Menezo В2 кинезисграмма обоих образцов была идентична, однако через 12 ч пребывания в СО-инкубаторе (условия для ОВО) была отмечена явная астеноспермия в образцах с безжелточной средой. Известно, что спермальная плазма различна по белковоуглеводному составу и содержит множество компонентов, которые могут оказывать негативное влияние на гаметы на этапах низкотемпературного криоконсервирования. Эта причина побудила нас провести сравнительное изучение влияния криоконсервирования со средой 3 по первому методу на нативные и отмытые от спермальной плазмы образцы донорской спермы. Установлено, что процент спермиев группы а был выше в не отмытых перед криоконсервированием образцах в сравнении с отмытыми эякулятами (35 и 28 соответственно). Процент морфологически неповрежденных сперматозоидов в обоих случаях был практически неизмененным по отношению к контролю, однако процент жизнеспособных форм (с неповрежденной мембраной) был значительно ниже в отмытых образцах (65 и 57 соответственно, р<0,005). Необходимо отметить, что несмотря на повышение концентрации сперматозоидов в образце после отмывки, количество летальных повреждений не снизилось, в то время как уменьшилось количество спермодоз от одного донора, что, естественно, нерентабельно для работы банка. Таким образом, эти данные свидетельствуют о возможности замораживания спермиев человека в открытой системе простым и недорогостоящим методом, который может использоваться для хранения мужских гамет. На базе Института проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины были организованы Центр по лечению бесплодия и банк для использования в программе инсеминации криоконсервированной всесторонне исследованной спермой донора (ИКСД). 25 женщинам в возрасте 23-33 лет было проведено лечение методом искусственной инсеминации спермой донора, криоконсервированной по вышеописанному методу. Показание к проведению ИКСД - нарушения сперматогенеза у мужей супружеских пар (азооспермия, некроспермия). Проведено 45 циклов ИКСД. Получено 9 беременностей (36% - на пациента, 20% - на цикл инсеминации). Таким образом, использование криоконсервированной спермы позволяет провести тщательный контроль донорской спермы, обеспечить в нужное время материалом программы ИКСД, IVF, ICSI, дает возможность подбора донора по группам крови и фенотипическим параметрам. Информация о конгрессах, конференциях, симпозиумах 1-й Северный конгресс по эндометриозу Стокгольм, Швеция, 19-21 апреля, 2001 Ежегодная встреча Американского колледжа по акушерству и гинекологии Чикаго, США, 28 апреля - 2 мая, 2001 Имплантация у человека: последние достижения и клинические аспекты Мадрид, Испания, 4-5 мая, 2001 VII Международный конгресс по андрологии Монреаль, Канада, 15-19 июня, 2001 ESHRE 2001 Лозанна, Швейцария, 1-4 июля, 2001 VII Международный конгресс по репродуктивной иммунологии Кроация, 2-6 июля, 2001 Международная конференция по андрологии и сексологии Египет, 6-7 сентября, 2001 II Международный конгресс по противоречиям в акушерстве, гинекологии и репродуктологии Париж, Франция, 6-9 сентября, 2001 57 Встреча Американского общества репродуктивной медицины Орландо, Флорида, 20-25 октября, 2001 17 Конгресс по фертильности и стерильности Мельбурн, Австралия, 24 ноября - 1 декабря, 2001 9 Всемирный конгресс по гинекологической эндокринологии Гон-Конг, 2-5 декабря, 2001 VIII Всемирный конгресс по эндометриозу Сан-Диего, Калифорния, 24-27 февраля, 2002 В.И. Грищенко, Н.Н. Чуб, М.И. Крамар, Е.К. Алипова, А.Г. Геродес, Т.К. Энтина Институт проблем криобиологии и криомедицины Национальной АН Украины, Харьков
В больничной столовой. Больной говорит заведующему столовой: - Неужели вы думаете, что я буду это есть? Позовите главврача! - Бесполезно. Он тоже не будет. |
