К оглавлению...

Приложение 1.

Методы выявления тканевых форм микромицетов

Импрегнация по методу Гомори-Грокотт.

Фиксация: 10% формалин.

Растворы: 2% хромовая кислота

5% нитрат серебра

3% метенамин:

Hexamethylentetraamine 3,0

дистиллированная вода 100.0

5% буры

Маточный раствор метенамин-серебра:

5% нитрат серебра 5,0

3% метенамин 100,0

(раствор сохраняется в холодильнике в течение месяца).

1% Na бусульфит

0,1% хлорное золото (раствор может быть использован повторно).

2% Na тиосульфат (гипосульфит)

Маточный раствор светового зеленого

Light green (yellow) 0,2

Дистиллированная вода 100,0

Ледяная уксусная кислота 0,2

Рабочий раствор светового зеленого:

Маточный раствор 10,0

Дистиллированная вода 50,0

Процедура окраски:

1. Денарафинированные срезы довести до воды.
2. Обработать 5% хромовой кислотой в течение 1 часа.
3. Промыть проточной водой в течение нескольких секунд.
4. Промыть 1% раствором биосульфита Na в течение 1 мин для освобождения от остатков хромовой кислоты.
5. Промыть проточной водой 5-10 минут.
6. Промыть в 3-4 порциях дистиллированной воды.
7. Препараты поместить в рабочий раствор метанамин-серебра при 58-60 ^оС на 30-60 минут до приобретения ими желтовато-коричневой окраски. Контролировать окраску под микроскопом.
8. Промыть в 6 порциях дистиллированной воды.
9. Тонировать в 0,1% растворе хлорного золота в течение 2-5 минут.
10. Промыть в дистиллированной воде.
11. Закрепить окраску в 2% растворе Na тиосульфата в течение 2-5 минут.
12. Промыть в проточной воде.
13. Докрасить в рабочем растворе светового зеленого 30-45 секунд.
14. Дегидротировать и заключить препараты в бальзам.

Результаты: Грибы окрашены очень контрастно в черный цвет. Муцин – в темно-серый цвет.

Внутренние части гифов грибов – в темно-розовый. Окружающие ткани

окрашены в светло-зеленый.

Источник: Grocott R.C. // Am.J.ournal of Clinical Path., 1955.- P. 975-979.

Окраска по методу Гридли

Фиксация: 10% формалин либо другие методы фиксации.

Растворы:

4% раствор хромовой кислоты

Реактив Шиффа

1Н HCl

10% метабисульфит Na

Сернистая вода: 10% Na метабисульфит – 6,0

1Н HCl

Дистиллированная вода

Раствор альдегид фуксина:*

Основной фуксин – 1,0

Этиловый спирт 70% - 200,0

Паральдегид – 2,0

HCl концентрированная – 2,0

Хранить в холодильнике.

Раствор Metanil Yellow:

Metanil Yellow – 0,25

Дистиллированная вода – 100,0

Ледяная уксусная кислота – 2 gtt

Процедура окраски

1. Мазковые препараты, отпечатки или денарафинированны срезы довести до воды.
2. Залить 4% хромовой кислотой на 1 час.
3. Промыть проточной водой – 5 мин.
4. Препараты поместить в реактив Шиффа на 15-20 мин.
5. Промыть в 3-х порциях сернистой воды.
6. Промыть проточной водой – 15 мин.
7. Препараты поместить в раствор альдегид фуксина на 15-30 мин.
8. Пролить излишки окраски 96% этиловым спиртом.
9. Промыть в воде.
10. Докрасить раствором метаниловым желтым – 1 мин.
11. Промыть в воде.
12. Дегидратировать 96% спиртом, просветлить в ксилоле и заключить в бальзам.

Результаты: Грибы, эластические волокна и муцин – розовые до пурпурных. Другие тканевые

структуры – желтые.

Источник: Gridley M.F. Am.J.Clin.Path., 23, 303-307, 1953.

Окраска методом Грама в модификации Боголепова

1. На фиксированный мазок наливают свежеприготовленные раствор эозина 2-3 мин. (насыщенный спиртовой р-р эозина 5 мл + H₂O дистил.95 мл).
2. Сливают краску и, не споласкивая в воде, подсушивают фильтрованной бумагой.
3. Окрашивают карболовым генцианвиолетом (через фильтрованную бумагу) – 5 мин. (1 часть насыщенного спиртового раствора генцианвиолета. 10 частей 2% водного р-ра карболовой кислоты).
4. Ополаскивают препарат в водопроводной воде 15-30 ”.
5. Обрабатывают раствором Люголя 2-3 мин (кристаллический I – 1 г , KI – 2 г, дистил. вода – 300 мл). Раствор хранить в темноте. Обсушивают фильтрованной бумагой.
6. Дифференцируют 96 ^о спиртом, наливая и сливая его, пока отходит синяя краска и не обесцвечивается мазок (~ 20-60 ”).
7. Хорошо промывают в проточной воде и высушивают фильтрованной бумагой.

Результат: Грам + микроорганизмы окрашиваются в темно-синий цвет. Особенно четко

выявляются актиномицеты и нокардии. Дрожжеподобные грибы (Грам+) окрашиваются непостоянно.

Окраска по методу Brown и Brenn

(модификация окраски по Граму)

Фиксация: 10 % формалин

Растворы:

1% кристалвиолет

5% Na-бикарбонат

Раствор Люголя:

Йод кристаллический – 1,0

Йодистый натрий – 2,0

Дистиллированная Н₂О – 300,0

Насыщенный раствор основного фуксина:

Основной фуксин ~ 0,25

Дистиллированная Н₂О – 100,0

Рабочий раствор основного фуксина

Насыщенный раствор основного фуксина – 0,1

Дистиллированная Н₂О – 100,0

0,1% раствор пикриновой кислоты в ацетоне.

Процедура окраски

1. Мазковые препараты, отпечатки или денарафинированны срезы заливают 1 мл (20 gtt) 1% раствора кристалвиолета и добавляют 5 gtt 5% раствора бикарбоната na. Слегка перемешивают в течение 1 мин. (Возможно предварительное смешение растворов).
2. Промыть проточной водой.
3. Обработать раствором Люголя в течение 1 мин.
4. Прополоскать в воде и просушить фильтрованной бумагой.
5. Обесцветить смесью равных частей эфир-ацетона до отхождения краски.
6. Окрасить рабочим раствором основного фуксина – 1 мин.
7. Промыть водой и сполоснуть в ацетоне.
8. Дифференциальная окраска 0,1% пикриновой кислотой в ацетоне, пока препарат не станет желто-розового цвета.
9. Быстро сполоснуть в ацетоне, затем в смеси ацетол-ксилол, затем в ксилоле.
10. Заключить препарат в бальзам.

Результаты: Грам-положительные микроорганизмы – лилово-синие. Грам-отрицательные - красные. Ядра клеток – красно-коричневые. Другие тканевые структуры – желтые.

Источник: Brown J.H. and Brenn L. Bulleten of the Hopkins Hospital, 48, 69, 1931.

Окраска методом Циля в модификации Киньона

1. На фиксированный мазковый препарат наливают через фильтрованную бумагу карболовый фуксин Киньон и подогревают над пламенем спиртовки до появления паров (фуксин основной – 4 г., фенол – 8 г, спирт 96 ^о – 20 мл, дист. вода – 100 мл).
2. Cливают краску, удаляют фильтрованную бумагу и основательно промывают в водопроводной воде.
3. Дифференцируют 1% водным р-ром H₂SO₄ до обесцвечивания (30-60”).
4. Докрашивают 2,5% р-ром метиленового синего на 96 ^о спирте (30”).
5. Споласкивают в воде и высушивают фильтрованной бумагой.

Результат: Кислотоупорные микроорганизмы (микобактерии ТБЦ, лепры и нокардии, а также спорообразующие дрожжи) окрашиваются в красный цвет на голубом фоне.

Окраска глюкозоамингликаном (кислых полисахаридов) альциановым синим по методу Моури (1960)

1. Денарафинируют срезы до воды.
2. Помещают на 1-2 часа в 0,5-2% АС на 3% уксусной кислоты или на 0,1 М буфера (цитрат Na – HCl) с рН 2,2-2,4.
3. Промывают в 3% уксусной кислоте, затем в воде.
4. Проводят через спирты и заключают в бальзам.

Результат: Капсулы Cryptococcus neoformans и Cryptococсus albidus окрашены в ярко-голубой цвет.

Окраска калькофлуором белым

Приготовление красителя: растворить 0,1 г калькофлуора белого (M2R) в 100,0 мл дистиллированной воды при слабом нагревании. После этого смешать небольшую каплю 10% раствора КОН на предметном стекле с каплей 0,1 % раствора красителя и поместить в приготовленную смесь исследуемый объект, покрыть покровным стеклом и осторожно нагреть.

Рассматривать в УФЛ при малом, а затем большом увеличении.

Результат: дрожжевые клетки, псевдомицелий и мицелий выявляются в виде яркой яблочно-зеленой флуоресценции. Особенно четко становятся видны септы грибов.

Примечание: Поскольку смесь растворов (0,1%) калькофлуора и (10%) КОН при хранении выпадает в осадок, каждый раствор сохраняется по отдельности.

Приложение 2.

Наиболее часто употребляемые питательные среды для выделения и культивирования грибов

Агар Сабуро (наиболее широко используемая питательная среда):

Глюкозы - 4 г

Пептона - 1 г

Агара - 1,8 г

Воды - 100 мл

Глюкозный бульон Сабуро:
Глюкозы - 40 г
Пептона - 10 г
Воды - 1000 мл

Нагревают до кипения и затем разливают в пробирки по 10 мл в каждую. Стерилизация при 1 атм. - 15 минут.

Сусло – агар /другая, широко распространенная среда, применяемая для первичного выделения дерматофитов и дрожжевых грибов/:

Солодовое сусло получают на пивоваренных заводах. Оно содержит 10-15% сахара и имеет плотность 16-18 ^о по Биллингу. Сусло фильтруют, разбавляют в 2 раза водопроводной водой, разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при 1 атм. 30 минут. Затем на сусло готовят 2% агар.

Картофельный агар с глюкозой:

Среда рекомендуется для выявления типов роста /филаментации/ аспорогенных дрожжей при посеве штрихами в чашки Петри. Очищенный и измельченный картофель /100 г/ заливают водопроводной водой /500 мл/ и кипятят в течение 15 мин. После этого отвар процеживают через несколько слоев марли и стерилизуют при 120 ^о в течение 30 минут. Перед употреблением отвар фильтруют через бумажный фильтр, добавляют 1% глюкозы и 2 % агара. Среду стерилизуют при 110 ^оС в течение 20 -30 минут.

Среда Городковой /среда для получения аскоспор у дрожжей/:

Готовят гипсовые блоки с широким основанием и ставят в чашки Петри с небольшим слоем пивного сусла. Жидкость должна смочить только часть их поверхности, остальная из-за капиллярности будет влажной.

Мясного бульона - 1 мл
Глюкозы - 0,25 г
Натрий хлористый - 0,5 г
Желатина - 1 г

Воды - 100 мл

Стерилизуют 15 минут пря 110 ^оС.

Добавление к любой питательной среде пенициллина и стрептомицина 100 -200 ЕД., особенно при первичных посевах, значительно уменьшает возможность загрязнения микробиотой.

Агар Чапека

Глюкоза – 20,0 г

K₂HPO₄ – 1,0 г

NaNO₃ - 3,0 г

KCl – 0,5 г

MgSO₄ – 0,5 г

FeSO₄ – 0,015 г

Агар – 20,0 г

Водопроводная вода – 1 л

Стерилизуют 30 минут при 0,5 атм.; рН после стерилизации 6,2-6,4.

К оглавлению...